周春華，陸斌，戴春，童瑞敏，蔣硯秋

揚中市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 鎮(zhèn)江 212200

胃癌一般起源于胃黏膜細(xì)胞，最常見的病理類型是腺癌[1]。胃癌是多種因素共同作用的結(jié)果，在患者已有慢性炎癥、慢性萎縮性胃炎等基本病因或感染、環(huán)境等多種因素的作用下，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴?，其誘發(fā)因素主要包括感染、環(huán)境、飲食及遺傳因素等[2]。臨床中手術(shù)治療是胃癌最重要的治療方法，主要是通過胃癌根治術(shù)進(jìn)行治療，但胃癌根治術(shù)后多數(shù)患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]。脫落細(xì)胞是指在自然管腔器官內(nèi)表面黏膜正常的情況下，人體器官黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生脫落，包括自然脫落和病變脫落。臨床上主要采用腹腔沖洗細(xì)胞學(xué)（peritoneal lavage cytology，PLC）檢測人體各部位的脫落細(xì)胞，具有簡單易行、標(biāo)本易獲取等優(yōu)點，但因其檢測靈敏度低而在臨床上的使用范圍較小，未獲得廣泛應(yīng)用[4]。隨著醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）廣泛應(yīng)用于臨床[5]。FCM可對上萬個細(xì)胞進(jìn)行高速分析，并且能夠從單個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，在臨床中可用于外周白血病細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的檢測，其中FCM-DNA倍體分析在惡性腫瘤的診斷中逐漸被廣泛應(yīng)用[6]。本研究探討了FCM-DNA倍體分析在胃癌手術(shù)患者腹腔脫落腫瘤細(xì)胞檢測中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月至2021年3月?lián)P中市人民醫(yī)院收治的胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胃癌；②接受胃癌根治術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②依從性差；③合并腹膜、淋巴結(jié)及其他臟器轉(zhuǎn)移。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入68例患者。其中，男45例，女23例；年齡30～75歲，平均（51.27±10.34）歲；胃癌發(fā)生部位：胃上部15例，胃中部18例，胃下部31例，胃食管結(jié)合部4例；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期32例，Ⅳ期9例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

采集腹腔沖洗液：手術(shù)麻醉消毒后，利用電刀進(jìn)行開腹探查，采用生理鹽水沖洗胃部，待生理鹽水沖洗液被吸收后，加入4%的檸檬酸鈉抗凝劑進(jìn)行抗凝。

PLC檢測：將抗凝后的腹腔沖洗液離心5 min，制成薄片，對標(biāo)本進(jìn)行Papanicolau法染色，細(xì)胞學(xué)醫(yī)師閱片并采用高清晰度彩色病例圖文報告分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描觀察。

FCM-DNA檢測：①取腹腔積液100 ml，加入10 ml枸櫞酸鈉抗凝，待兩者充分混勻后，取20 ml，室溫下3000 r/min離心10 min，分離并去除上清液，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗2次，室溫下3000 r/min離心10 min，采用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，避光靜置10 min后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞倍體檢測；②在第1管內(nèi)加入雞紅細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞并將DNA熒光信號峰值作為參考值，在第2管內(nèi)加入腹腔沖洗液內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析，并根據(jù)指數(shù)分析做出直方圖。

1.3 觀察指標(biāo)

比較PLC檢測和FCM-DNA檢測腫瘤細(xì)胞的陽性率，比較不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測的陽性率，比較不同臨床特征胃癌患者FCM檢測陽性率和PLC檢測陽性率。分析FCM-DNA和PLC檢測對胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估FCM-DNA和PLC檢測對胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞陽性檢出率的比較

24例患者經(jīng)PLC檢測出脫落腫瘤細(xì)胞，陽性率為35.29%（24/68）；46例患者經(jīng)FCM-DNA檢測出異倍體腫瘤細(xì)胞，陽性率為67.65%（46/68）。FCM-DNA檢測腫瘤細(xì)胞的陽性率高于PLC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.248，P＜0.05）。

2.2 不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率比較

彌漫性、漿膜浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陽性、腫瘤結(jié)節(jié)陽性、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率分別高于局限性、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陰性、腫瘤結(jié)節(jié)陰性、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同腫瘤直徑、分化程度的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胃癌患者FCM-DNA檢測陽性情況的比較（n=68）

2.3 不同臨床特征胃癌患者FCM 檢測陽性率和PLC 檢測陽性率的比較

局限性、彌漫性、漿膜浸潤、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、腫瘤結(jié)節(jié)陰性、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陽性、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的FCM-DNA檢測陽性率均高于PLC檢測陽性率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者FCM檢測陽性情況和PLC檢測陽性情況的比較

2.4 FCM-DNA和PLC 檢測對胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

采用ROC曲線評估FCM-DNA和PLC檢測對胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，結(jié)果顯示，F(xiàn)CMDNA預(yù)測胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC為0.785，PLC預(yù)測胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC為0.641。（表3）

表3 FCM-DNA和PLC檢測對胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

3 討論

胃癌是發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是中國常見的惡性腫瘤之一，其在中國的發(fā)病率居全部惡性腫瘤首位，好發(fā)年齡為50歲以上，男性居多，它是由多種因素共同造成的，目前幽門螺桿菌感染被認(rèn)定為Ⅰ類致癌原[7]。臨床上早期胃癌患者一般無明顯癥狀，部分患者有輕微不適，可能被診斷為普通胃炎，因此不易引起重視，進(jìn)展期胃癌患者可出現(xiàn)上腹部痛、體重下降等不適，晚期胃癌患者還會出現(xiàn)貧血、厭食等癥狀[8]。根治性手術(shù)是治療胃癌的主要方法，對于進(jìn)展期胃癌患者，需根據(jù)病理類型及臨床分期，以手術(shù)治療為主，聯(lián)合化療、靶向治療等其他治療方法，目的主要是減輕患者痛苦，改善患者生活質(zhì)量，延長患者生存期[9]。近年來，胃癌根治術(shù)后患者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量得到了有效提高，但進(jìn)展性胃癌侵犯漿膜，導(dǎo)致多數(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)部位是腹腔[10]。細(xì)胞脫落主要包括自然脫落和發(fā)生病變的脫落，胃癌根治術(shù)后腹腔內(nèi)未完全清除的腫瘤細(xì)胞也會發(fā)生脫落，可成為導(dǎo)致胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的一個重要原因，腫瘤細(xì)胞脫落情況可為胃癌患者的預(yù)后評估提供依據(jù)[11]。臨床上可利用細(xì)針抽取少量病變組織并制作涂片進(jìn)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查，其特異度高，操作相對簡單，但由于靈敏度較低導(dǎo)致應(yīng)用范圍較小[12]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，臨床中逐漸開始采用FCM對脫落腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，主要是對脫落細(xì)胞進(jìn)行DNA定量檢測，若發(fā)生惡性腫瘤，其致癌因素會損傷細(xì)胞DNA，可能會使DNA含量異常，從而導(dǎo)致正常體細(xì)胞變?yōu)槟[瘤細(xì)胞[13]。研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)異倍體細(xì)胞而難以確定為腫瘤組織，不易發(fā)現(xiàn)，但最終會發(fā)展為腫瘤，因此細(xì)胞DNA含量及倍體的定量分析對診斷惡性腫瘤具有重要意義[14]。文獻(xiàn)報道，在腹腔積液中采用FCM-DNA倍體分析檢測腫瘤細(xì)胞的靈敏度為61%～81%，特異度為70%～93%[15]。本研究結(jié)果顯示，24例患者經(jīng)PLC檢測出脫落腫瘤細(xì)胞，陽性率為35.29%（24/68）；46例患者經(jīng)FCM-DNA檢測出異倍體腫瘤細(xì)胞，陽性率為67.65%（46/68）。FCMDNA檢測腫瘤細(xì)胞的陽性率高于PLC（P＜0.05）。彌漫性、漿膜浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陽性、腫瘤結(jié)節(jié)陽性、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的胃癌患者FCM-DNA檢測陽性率分別高于局限性、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陰性、腫瘤結(jié)節(jié)陰性、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（P＜0.05）。表明FCM-DNA檢測腫瘤細(xì)胞的陽性率會隨著浸潤深度增加、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陽性、病理分期的升高而增加。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA定量檢測分析結(jié)果與腫瘤形成及腫瘤臨床分期具有相關(guān)性，且腫瘤呈彌漫性、腫瘤惡性程度高的患者FCM-DNA檢測陽性率較高[16]。本研究結(jié)果還顯示，局限性、彌漫性、漿膜浸潤、漿膜未浸潤、腫瘤侵襲面積≥10 cm2、腫瘤侵襲面積＜10 cm2、腫瘤結(jié)節(jié)陰性、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移陽性、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的FCM-DNA檢測陽性率均高于PLC檢測（P＜0.05）。表明FCM-DNA檢測脫落腫瘤細(xì)胞的陽性率高于PLC檢測。ROC曲線分析結(jié)果顯示，F(xiàn)CM-DNA預(yù)測胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度分別為80.23%、80.74%，而PLC預(yù)測胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度分別為30.25%、80.84%，說明FCM-DNA檢測的靈敏度高于PLC檢測，前者能夠提高脫落腫瘤細(xì)胞的檢出率，降低胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。

綜上所述，采用FCM-DNA檢測腹腔脫落腫瘤細(xì)胞的陽性率高，且對胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)具有較高的預(yù)測價值，能夠為胃癌患者的個體化治療及預(yù)后評估提供依據(jù)。