印雙紅 ， 張俊波 ， 李寅翠 ， 張孟琴 ， 毛 宏 ， 易 萌 ， 蔡春連 ， 張 紅 ， 李志強(qiáng) ， 陳創(chuàng)夫

(1.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院 ， 貴州 銅仁 554300 ； 2.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院 ， 貴州 銅仁 554300 ；3.銅仁學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 貴州 銅仁 554300 ； 4.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院 ， 貴州 銅仁 554300 ； 5.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院 ， 河南 商丘 476000 ； 6.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 新疆 石河子 832000)

布魯氏菌病是一種人獸共患傳染病，布魯氏菌疫苗仍存在安全性差、免疫期短、重復(fù)免疫等一些缺陷[1]，現(xiàn)有的亞單位疫苗還未達(dá)到減毒活疫苗的保護(hù)水平[2]，與減毒活疫苗相比，亞單位疫苗具有避免發(fā)生免疫副反應(yīng)并有助于血清學(xué)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)[3]，用于布魯氏菌病亞單位疫苗研制的蛋白主要包括分子伴侶DnaK、外膜蛋白和AsnC等[4-5]，但這些融合蛋白疫苗不能持續(xù)誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

DnaJ是一種具有分子伴侶特性的蛋白質(zhì)，DnaJ蛋白在生命體細(xì)胞中具有活性，功能為糾正或清除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊、損傷失去活性的蛋白質(zhì)和指導(dǎo)生成正確且具有生物活性的蛋白質(zhì)，從而保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激破壞[6]。本試驗(yàn)通過對(duì)DnaJ蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化，并研究其在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，旨在為該蛋白的功能和疫苗開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、蛋白Marker和DNA Marker,均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒pET-30a，購自Novagen公司；小鼠IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a ELISA試劑盒，均購自美國GBD公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 菌株和細(xì)胞 布魯氏菌M5-90、DE3感受態(tài)細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞為貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡體重約17 g的BALB/c小鼠，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DnaJ蛋白的生物信息學(xué)分析 利用Predicting Antigenic Peptides在線預(yù)測(cè)DnaJ蛋白的抗原決定簇。使用SOPMA在線軟件分析預(yù)測(cè)DnaJ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4.2DnaJ基因的合成及重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-DnaJ的構(gòu)建 在布魯氏菌M5-90株的DnaJ基因序列(BMEI1513)上接上NdeI/Hind III酶切位點(diǎn)，然后送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成基因序列。對(duì)pET-30a表達(dá)載體進(jìn)行NdeI/Hind III雙酶切，然后將DnaJ(NdeI/Hind III)目的片段連接至pET-30a載體，連接體系為20 μL：pET-30a 4.0 μL，10×Ligation Buffer 4.0 μL，T4 DNA Ligase 0.3 μL，ddH2O 9.7 μL。22 ℃連接16 h。用試劑盒提取pET-30a-DnaJ質(zhì)粒，然后對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切體系為30 μL：NdeI內(nèi)切酶1.0 μL，Hind III內(nèi)切酶1.0 μL，質(zhì)粒pET-30a-DnaJ 4.0 μL，10×Ligation Buffer 3.0 μL，ddH2O 21.0 μL，然后將質(zhì)粒送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，然后進(jìn)行DnaJ蛋白表達(dá)。

1.4.3 DnaJ蛋白的表達(dá)及純化 將PET-30a-DnaJ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DE3感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、220 r/min振搖至菌體OD600值為0.6～0.8，向細(xì)菌培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑IPTG(1 mmol/L)，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)2、4 h和6 h以誘導(dǎo)DnaJ蛋白的表達(dá)，用20 μL的PBS重懸菌體并加入20 μL的5×Loading Buffer，利用12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，凝膠經(jīng)染色和脫色后檢測(cè)DnaJ蛋白的表達(dá)情況。將培養(yǎng)好的菌液12 000 r/min離心6 min，加入裂解液Liysis 4 ℃裂解10 h，在液氮和37 ℃水浴鍋中反復(fù)凍融3次后，對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心25 min后收集沉淀，加入8 mol/L尿素，用0.45 μm濾膜過濾，用AKTAxpress智能多維純化系統(tǒng)對(duì)DnaJ蛋白純化，收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測(cè)DnaJ蛋白的純化效果。

1.4.4 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7中的IFN-γ和IL-4檢測(cè) 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，試驗(yàn)組每孔加入25 mg的DnaJ蛋白，對(duì)照組添加PBS，在4、12 h和24 h收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定IFN-γ和IL-4的水平，操作方法見試劑盒說明書。

1.4.5 小鼠脾細(xì)胞中的IFN-γ和IL-4檢測(cè) 選取6周齡的BALB/c小鼠，將正常小鼠斷頸椎處死(每組5只)，無菌取出脾臟，通過勻漿法獲得單細(xì)胞懸液，利用ACK紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞。脾細(xì)胞在96孔微量滴定板中以4×105個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行培養(yǎng)；試驗(yàn)組每孔加入25 mg的DnaJ蛋白，對(duì)照組添加PBS。在37 ℃、5%CO2條件下與細(xì)胞共同孵育12 h和24 h，收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)脾細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-4水平，操作步驟見試劑盒使用說明書。

1.4.6 小鼠免疫及體液免疫水平檢測(cè) 將6周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，20只/組。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射DnaJ蛋白(50 μg/只)，對(duì)照組小鼠注射PBS(200 μL/只)，共免疫2次，免疫間隔21 d，首次免疫后的第7、21天和第35天對(duì)小鼠斷尾采血分離血清，用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IgG1和IgG2a水平，操作步驟見試劑盒使用說明書。

1.4.7 DnaJ蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)IFN-γ和IL-4水平分析 取1.4.6中免疫35 d的小鼠，將小鼠斷頸椎處死(每組5只)，無菌取出脾臟，通過勻漿法獲得單細(xì)胞懸液，利用ACK紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞。脾細(xì)胞在96孔微量滴定板中以4×105個(gè)/孔進(jìn)行培養(yǎng)；每孔加入25 mg的DnaJ蛋白或熱滅活的布魯氏菌16M裂解液，陽性對(duì)照組添加0.5 mg的ConA，陰性對(duì)照組添加RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下與細(xì)胞共同孵育72 h，收集細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞中IFN-γ和IL-4的水平，操作方法見試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 DnaJ重組蛋白的生物信息學(xué)分析 Predicting Antigenic Peptides預(yù)測(cè)DnaJ蛋白有11個(gè)抗原決定簇，分別在第4～12、21～30、46～53、71～78、149～172、178～188、209～217、227～245、254～262、265～271、285～293位氨基酸處(表1)。SOPMA預(yù)測(cè)DnaJ蛋白中有68個(gè)氨基酸參與形成α-螺旋，占總氨基酸的比例為21.73%；54個(gè)氨基酸參與延伸鏈的形成，占總氨基酸的比例為17.25%；21個(gè)氨基酸參與β-折疊的形成，占總氨基酸的比例為6.71%；170個(gè)氨基酸參與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的形成，占總氨基酸的比例為54.31%(圖1)。

表1 DnaJ蛋白抗原決定簇的預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of antigen clusters in DnaJ protein

圖1 DnaJ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of secondary structure in DnaJ protein

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-DnaJ的構(gòu)建及鑒定 對(duì)重組載體pET-30a-DnaJ進(jìn)行NdeI/Hind III雙酶切，得到942 bp的條帶，與理論值相符(圖2)，同時(shí)測(cè)序結(jié)果與GenBank中一致，表明重組質(zhì)粒pET-30a-DnaJ構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET-30a-DnaJ的構(gòu)建及鑒定Fig. 2 Construction and verification of recombinant plasmid pET-30a-DnaJM:DNA marker 4 500; 1:pET-30a-DnaJ的酶切產(chǎn)物; 2:pET-30a-DnaJ質(zhì)粒M:DNA marker 4 500; 1:pET-30a-DnaJ digestion product;2:pET-30a-DnaJ plasmid

2.3 DnaJ蛋白的表達(dá)及純化 表達(dá)結(jié)果顯示，得到與預(yù)期蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小一致的37.7 kDa DnaJ蛋白(圖3A)。純化結(jié)果顯示，DnaJ蛋白的純化效果較好(圖3B)。

圖3 融合蛋白DnaJ的表達(dá)鑒定(A)及純化(B)Fig. 3 Expression,identification (A) and purification (B) of fusion protein DnaJM:蛋白分子marker; 1:IPTG誘導(dǎo)2 h的pET-30a-DnaJ; 2:IPTG誘導(dǎo)4 h的pET-30a-DnaJ; 3:IPTG誘導(dǎo)6 h的pET-30a-DnaJ; 4:DE3; 5:未純化蛋白; 6:純化蛋白M:Protein molecule marker; 1:Induced pET-30a-DnaJ for 2 h by IPTG; 2:Induced pET-30a-DnaJ for 4 h by IPTG; 3:Induced pET-30a-DnaJ for 6 h by IPTG; 4:DE3; 5:Unpurified protein; 6:Purified protein

2.4 DnaJ蛋白誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4 結(jié)果如圖4所示，在4 h時(shí)，DnaJ蛋白刺激RAW 264.7細(xì)胞中的IFN-γ水平顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05)，而IL-4水平無明顯變化(P>0.05)；在12 h和24 h時(shí)，DnaJ蛋白刺激RAW 264.7細(xì)胞中的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，DnaJ蛋白可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4。

圖4 DnaJ融合蛋白誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4水平變化Fig.4 The levels of IFN-γ and IL-4 cytokine production in RAW 264.7 cells after induction with DnaJ fusion protein與PBS對(duì)照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01； 下圖同Compare to group PBS, *：P<0.05，**：P<0.01. The same as below

2.5 DnaJ蛋白誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4 結(jié)果如圖5所示，在12 h和24 h時(shí)，DnaJ蛋白刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，DnaJ蛋白可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng)。

圖5 DnaJ融合蛋白誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4水平變化Fig.5 The levels of IFN-γ and IL-4 production in mouse splenocytes after induction with DnaJ fusion protein

2.6 DnaJ蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng) 結(jié)果如圖6所示，免疫DnaJ蛋白的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4水平均極顯著高于免疫PBS的小鼠(P<0.01)；ConA可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IFN-γ和IL-4；而RPMI 1640和免疫PBS不能誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和IL-4。結(jié)果表明，DnaJ蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng)。

圖6 DnaJ融合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)變化Fig. 6 Changes in cellular immune response induction with DnaJ fusion protein

2.7 DnaJ蛋白可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng) 結(jié)果如圖7所示，在7 d時(shí)，免疫DnaJ蛋白的小鼠產(chǎn)生的IgG1和IgG2a與PBS對(duì)照組相比無明顯變化(P>0.05)；在21 d和35 d時(shí)，免疫DnaJ蛋白的小鼠產(chǎn)生的IgG1和IgG2a水平極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明，DnaJ蛋白免疫小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG1和IgG2a的體液免疫反應(yīng)。

圖7 DnaJ融合蛋白誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)變化Fig. 7 Changes in humoral immune response induction with DnaJ fusion protein

3 討論

Th1型免疫反應(yīng)的主要特性是產(chǎn)生IFN-γ，以抵抗布魯氏菌的感染[7]。巨噬細(xì)胞在布魯氏菌感染過程中可分泌大量IFN-γ以殺死胞內(nèi)的細(xì)菌[8]。IL-4由Th2型細(xì)胞產(chǎn)生，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[9]。IgG1抗體的產(chǎn)生依賴于Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌，而IgG2a抗體的產(chǎn)生依賴于Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的分泌[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DnaJ融合蛋白可刺激小鼠巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞及小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生高水平的IFN-γ和IL-4，且在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的IgG1和IgG2a抗體，表明DnaJ蛋白可誘導(dǎo)小鼠體外細(xì)胞和體內(nèi)產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng)，且Th1和Th2型免疫反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)了IgG1和IgG2a抗體產(chǎn)生，增加了小鼠的體液免疫。

DnaJ是刺激DnaK的ATP酶和蛋白折疊活性的輔助分子伴侶[11]。DnaJ作為毒力因子參與一些細(xì)菌的致病過程，影響細(xì)菌感染宿主細(xì)胞[12-13]。黏膜免疫的DnaJ蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗體、IL-10、IFN-γ和IL-17A，通過腹膜內(nèi)接種DnaJ后誘導(dǎo)小鼠IgG滴度和淋巴細(xì)胞增殖；黏膜免疫接種DnaJ蛋白能夠降低鼻或肺定植的肺炎球菌，并抵御不同種血清型肺炎球菌的感染，腹腔內(nèi)接種DnaJ蛋白也能夠抵御不同種血清型肺炎球菌的感染，DnaJ是肺炎球菌具潛力的候選蛋白疫苗[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌DnaJ蛋白可誘導(dǎo)較好的細(xì)胞和體液免疫，因此，該蛋白可作為候選的亞單位疫苗。

熱休克蛋白的誘導(dǎo)合成對(duì)于致病菌在宿主體內(nèi)存活至關(guān)重要[15]。肺炎鏈球菌DnaJ蛋白具有良好的免疫原性，且與其感染致病力相關(guān)[16]。研究表明，DnaJ在遲緩愛德華氏菌的致病中發(fā)揮重要作用，且具有免疫保護(hù)作用，因此DnaJ可用于控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的遲緩愛德華氏菌感染[17]。布魯氏菌的應(yīng)激反應(yīng)蛋白毒力因子包括Hfq、DnaK、DnaJ、HtrA和Lon。研究表明，Hfq在布魯氏菌致病中可調(diào)控大量靶標(biāo)基因的表達(dá)水平，影響布魯氏菌在宿主體內(nèi)的慢性持續(xù)性感染[18-19]。然而，目前只初步證明Lon、htrA、DnaJ和DnaK影響布魯氏菌的毒力[20-23]，它們?cè)诓剪斒暇虏≈械淖饔脵C(jī)制尚不清楚。本課題組前期已經(jīng)獲得了可作為候選疫苗株的布魯氏菌Hfq和DnaK基因缺失株，因此后期也將進(jìn)一步構(gòu)建DnaJ基因缺失株，獲得DnaJ基因調(diào)控布魯氏菌的毒力機(jī)制。