馬萍萍 ， 劉寶濤 ， 趙永達(dá) ， 劉煥奇 ， 鄒 明

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

大腸桿菌分為不致病的正常共生菌群和可引起人和動物不同癥狀的致病性大腸桿菌。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一類攜帶了1種或2種志賀毒素基因(stx)的新發(fā)高致病性食源性致病菌[1]，可引起腹瀉、出血性腸炎及溶血性尿毒綜合征(HUS)等，給公共衛(wèi)生和人類健康帶來威脅。牛、羊等反芻動物是STEC的主要儲存宿主[2]。

致病性主要通過相關(guān)毒力因子來表達(dá)，在與STEC相關(guān)的毒力因子中，最主要的是由stx基因編碼的志賀毒素。其次還有緊密素、菌毛、外膜蛋白和脂多糖等毒力因子[3]。血清型為O157∶H7的菌株是20年來大多數(shù)食源性疾病暴發(fā)的主要原因[4]，現(xiàn)有超過200種非O157血清型的STEC能引起人類疾病，其中O26、O45、O103、O111、O121和O145稱為“前6名的非O157型STEC血清型”[5]。

目前，致病菌的耐藥對人與動物健康構(gòu)成重大威脅，耐藥菌可通過食物鏈在人與食物、人與人或人與畜之間傳遞[6]。根據(jù)我國現(xiàn)有報道，國內(nèi)對牛源STEC的研究大部分都是從牛糞便或牛肉中分離到的，對牛奶中STEC的研究少有報道。因此，本試驗的目的是從奶牛糞便、牛奶以及牛場環(huán)境中分離鑒定STEC菌株，調(diào)查其流行情況、血清分型并分析其耐藥性，為指導(dǎo)合理用藥和保障公共衛(wèi)生安全提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 本實驗室保存的780株牛源大腸桿菌，包括牛奶源203株，糞便源475株，飲水源19株，污水源51株，土壤源32株。

1.2 試劑與藥品 LB肉湯、麥康凱瓊脂、MH肉湯和MH瓊脂，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；Taq酶、Marker 2 000，均購自TaKaRa公司。藥敏試驗藥物(氨芐西林、頭孢噻呋、萘啶酸、恩諾沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、鏈霉素、磷霉素、卡那霉素、氟苯尼考、阿米卡星、甲氧芐啶、磺胺甲噁唑)，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR檢測stx基因 煮沸法提取細(xì)菌的DNA，參考文獻(xiàn)[7]合成引物,引物序列見表1。通過PCR方法檢測stx1和stx2基因，擴增后測序。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：ddH2O 18.375 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.125 μL，DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.2 血清分型 O血清型的鑒定采用PCR方法檢測共30種不同特異性O(shè)抗原編碼基因[8]，包括O1、O2、O4、O6、O7、O8、O9、O15、O18、O21、O22、O25、O26、O45、O55、O78、O83、O86、O101、O103、O111、O113、O117、O121、O138、O145、O149、O157、O158和O165。

1.3.3 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100-S22，采用瓊脂稀釋法測定27株STEC菌株對13種抗菌藥的最小抑菌濃度(MIC)。13種抗菌藥物包括氨芐西林(AMP)、頭孢噻呋(CTF)、萘啶酸(NAL)、恩諾沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TET)、鏈霉素(STR)、磷霉素(FOS)、卡那霉素(KAN)、氟苯尼考(FFC)、阿米卡星(AMK)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(SXT)，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。分析得到的MIC值，判斷藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 STEC鑒定 經(jīng)測序比對，從22個牛場分離到的780株大腸桿菌中共鑒定出27株STEC，總檢出率為3.46%(27/780)。27株STEC菌株分別來自10個牛場，值得注意的是，場10中在牛奶和污水中同時檢出STEC，結(jié)果見表2。其中來源奶牛糞便、牛奶、飲水和污水的STEC菌株分別為17、7、2株和1株，檢出率分別為3.58%(17/475)、3.45%(7/203)、10.53%(2/19)和1.96%(1/51)。27株STEC中有9株僅攜帶stx1基因，6株僅攜帶stx2基因,同時攜帶stx1基因和stx2基因的有12株。

表2 牛源STEC的檢出率Table 2 Detection rates of STEC in cattle (%)

2.2 血清分型 對27株STEC通過PCR方法檢測了比較常見的或流行較高的30種O血清型，在鑒定出的14株STEC菌株中，分為9種不同的O血清型，鑒定結(jié)果表明，O78血清型菌株最多，有4株，占定型菌株的14.8%，為優(yōu)勢血清型，結(jié)果見表3。

表3 血清型鑒定結(jié)果Table 3 Detection results of O serotyping

2.3 藥敏試驗 對27株STEC進(jìn)行抗生素敏感性試驗，結(jié)果見表4。其中對四環(huán)素、氨芐西林有較強的耐藥性，耐藥率分別為88.9%和81.5%；對甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、頭孢噻呋和萘啶酸的耐藥率較高，分別為59.3%、37.0%和22.2%；其次是磷霉素和鏈霉素，均為18.5%；對恩諾沙星和氟苯尼考的耐藥率較低，均為11.1%；對阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星全部敏感。

表4 藥敏試驗結(jié)果Table 4 Drug sensitivity test results

3 討論

3.1 牛源STEC的檢出率分析 本試驗通過對青島地區(qū)奶牛場分離到的780株大腸桿菌進(jìn)行鑒定，共鑒定出27株STEC，總檢出率為3.46%(27/780)，其中牛糞便中的檢出率為3.58%(17/475)，低于文獻(xiàn)[9]報道的牛糞便中STEC的檢出率19.4%,與國內(nèi)其他地區(qū)相比有一定相似性，略高于邵純純[10]對山東濟寧和煙臺兩地區(qū)動物糞便中STEC的檢出率2.54%(26/1 022)；牛奶中STEC檢出率為3.45%(7/203)，低于文獻(xiàn)[11]報道的牛場牛奶中的檢出率6.59%(52/789)。本試驗發(fā)現(xiàn)，場10中在牛奶和污水中同時檢出STEC，這可能與奶牛場的飼養(yǎng)管理、養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)，分布于水中的STEC可能成為傳染源，因此應(yīng)該注意養(yǎng)殖場的環(huán)境衛(wèi)生。

3.2 STEC血清型分析 大腸桿菌在不同地區(qū)有不同優(yōu)勢血清型，本試驗通過PCR方法檢測了30種常見的STEC血清型，共鑒定出14株非O157型STEC，還有一些菌株未鑒定出血清型，血清型分布比較分散，其中O78型(4/14)最多。與Johnson等[12]報道的流行血清型O26、O45、O111、O103、O145和O121等具有一定的差異性。與薛濤等[13]報道的江蘇某奶牛場糞便中STEC的優(yōu)勢血清型為O4、O26和O93具有差異性。本試驗中血清型的分散性與胡彬等[14]對山東地區(qū)動物源糞便中非O157型STEC血清型的報道具有相似性，血清型的分散性反映了STEC菌株的復(fù)雜性和多態(tài)性，因此，應(yīng)加強對非O157血清型的監(jiān)測。

3.3 STEC的藥物敏感性分析 本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，27株STEC對四環(huán)素的耐藥率最高(88.9%)，其次為氨芐西林(81.5%)、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(59.3%)和頭孢噻呋(37.0%)，對阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星全部敏感。與國內(nèi)報道具有一定相似性，武瑞兵等[15](2015年)對牛肉源大腸桿菌耐藥性的研究顯示，四環(huán)素(89%)和氨芐西林(42%)的耐藥率最高；李明成[16](2005年)的研究中牛源STEC菌株對氨芐西林(88%)和四環(huán)素(88%)耐藥率最高。與白莉等[17](2014年)從食品中分離到STEC對氨芐西林的(57.8%)和四環(huán)素(73.3%)耐藥率差異較大，與磺胺甲噁唑的耐藥率(62.0%)接近，與阿米卡星的敏感率(97.8%)相似。本試驗中，STEC對四環(huán)素、氨芐西林、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑、頭孢噻呋的耐藥率較高，可能與四環(huán)素類藥物和磺胺類藥物被用作促生長劑在臨床使用多年，頭孢噻呋是動物專用藥物有關(guān)。第3代喹諾酮藥物耐藥率中恩諾沙星(11.1%)高于環(huán)丙沙星(0)和左氧氟沙星(0)，這與恩諾沙星是專用于獸醫(yī)臨床的第3代喹諾酮類藥物有關(guān)。同時本試驗菌株存在多藥耐藥現(xiàn)象，以2耐和3耐為主。因此，應(yīng)及時監(jiān)測并掌握STEC菌株的耐藥特點，為牛場合理用藥提供理論指導(dǎo)，根據(jù)耐藥譜有針對性地使用抗菌藥物，以減緩耐藥菌株的出現(xiàn)。