陳 霖 ， 陳泉瑛 ， 杜 園 ， 晉坤龍 ， 易小偉 ， 李 妍

(1. 吉林醫(yī)藥學院藥學院 ， 吉林 吉林 132013 ； 2. 吉林醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院 ， 吉林 吉林 132013)

神經膠質瘤(Glioma)簡稱膠質瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤，具有高侵襲性、易復發(fā)、高死亡率等特點[1]。臨床上膠質瘤以手術治療為主，并輔以放療、化療及免疫治療。膠質瘤手術全切率低，腫瘤易復發(fā)，且預后性差，故成為嚴重影響人類健康的腫瘤之一[2]。由于化療藥物毒副作用較多，且易產生耐藥性，因此天然藥物活性成分對抗膠質瘤的作用研究成為近年來的研究熱點[3-5]。

酸棗仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)是酸棗仁的主要活性成分。近年來，多項研究結果顯示，JuA具有廣泛的藥理作用。除傳統(tǒng)的寧心安神、鎮(zhèn)靜催眠作用外，JuA還具有抗氧化、保護心肌細胞、抗缺氧和抗腫瘤等多種藥理作用[6-7]。在以往的試驗中，本課題組發(fā)現一定濃度的JuA對膠質瘤U251細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴效應。本試驗在前期研究的基礎上，進一步探討了JuA抑制膠質瘤U251細胞增殖的相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系 神經膠質瘤細胞U251來自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 儀器與試劑 MCO-18AIC細胞培養(yǎng)箱(北京東方安若生化科技有限公司產品)；DL-CJ-IN超凈臺(蘇州凈化儀器廠生產)；MuseTM細胞分析儀(德國默克-密理博生物科技有限公司產品)；IX-70型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司產品)。JuA(≥98%，北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(元亨生物科技有限公司)；1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；AO/EB染料、胰蛋白酶(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品)。

1.3 細胞培養(yǎng) U251細胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100U/mL 鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 JuA的藥物配制 準確稱取JuA粉末溶于DMSO，配置成33.33 mmol/L的JuA儲存液，濾器過濾除菌后-20 ℃保存。JuA儲存液與1640培養(yǎng)基稀釋成終濃度分別為10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA工作液。

1.5 MuseTM細胞分析儀檢測細胞凋亡水平 取對數生長期U251細胞，用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，以終濃度為0(空白對照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。0.25%的胰蛋白酶消化，1.5 mL EP管中每管加入100 μL細胞及100 μL Annexin V 試劑，輕微震蕩混勻。室溫避光孵育20 min，使用MuseTM細胞分析儀進行檢測。

1.6 Hochest 33258染色觀察U251細胞核改變 取對數生長期U251細胞，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，接種于24孔板中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0(空白對照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2遍。各組細胞滴加Hoechst 33258染色液避光染色5 min，PBS清洗2遍，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 AO/EB染色觀察U251細胞凋亡 取處于對數生長期U251細胞，接種于無菌24孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。細胞貼壁后，加入終濃度分別為0(空白對照組)、10、30 μmol/L和50 μmol/L的JuA進行干預，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定10 min。各組加入AO/EB染色液避光染色5 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 MuseTM細胞分析儀檢測 如圖1所示，與空白對照組相比，經10、30 μmol/L和50 μmol/L JuA干預24 h，U251細胞凋亡數目增多，且隨著JuA干預濃度的增加，凋亡細胞逐漸增多，細胞晚期凋亡數目變化更為明顯。細胞凋亡趨勢具有劑量相關性，隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞總數逐漸增加(P<0.01)，見圖2。

圖1 MuseTM細胞分析儀檢測JuA 對U251細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of JuA on apoptosis of U251 cells as detected by MuseTM cell analyzer A：空白對照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

圖2 不同濃度的JuA對U251細胞晚期細胞凋亡率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of JuA on the late apoptosis rate of U251 cells **：與空白對照組相比，P<0.01；下同**：Compared with the blank control group,P<0.01. The same as below

2.2 Hochest 33258染色觀察 如圖3所示，空白對照組細胞核熒光染色均勻，呈淡藍色熒光，細胞核較大。與空白對照組相比，經不同濃度的JuA干預后，Hoechst 33258 染色陽性細胞數均增加，細胞核致密濃染，呈亮藍色熒光，且細胞核變小濃集，細胞染色質固縮、凝集。細胞核碎片化和邊緣化等典型凋亡細胞形態(tài)隨藥物濃度增加而變化顯著。

圖3 Hoechst 33258染色檢測JuA對U251細胞凋亡的影響(200×)Fig.3 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by hoechst 33258 staining (200×)A：空白對照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

2.3 AO/EB雙染觀察各組細胞凋亡水平 如圖4所示，空白對照組絕大多數細胞核呈現圓形或者橢圓形的亮綠色熒光。與空白對照組相比，不同濃度JuA干預后，橙紅色細胞核所占比例明顯增大。與空白對照組比較，JuA干預組細胞核形狀差異較大，橙紅色細胞核斑塊、碎片較多。且隨著藥物濃度的增加，上述改變越加明顯(P<0.01)，見圖5。

圖4 AO/EB染色檢測JuA對U251細胞凋亡的影響(200×)Fig.4 Effect of JuA induced apoptosis in U251 cells as revealed by AO/EB staining (200×)A：空白對照組； B：10 μmol/L JuA組； C：30 μmol/L JuA組； D：50 μmol/L JuA組A：Blank control group; B：10 μmol/L JuA group; C：30 μmol/L JuA group; D：50 μmol/L JuA group

圖5 不同濃度的JuA對U251細胞凋亡率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of JuA on apoptosis rate of U251 cells

3 討論

1978年，日本學者Otsuka 等從酸棗仁中分離得到JuA[8]，JuA屬于四環(huán)三萜類皂苷，是酸棗仁中含量最高的一種皂苷類成分[9]。近年來，對JuA藥理作用及相關機制的研究逐漸增多。研究表明，JuA可在體外引起肺癌細胞的凋亡，進一步的研究發(fā)現，JuA能夠通過直接作用于細胞膜表面的Fat 4蛋白，進而活化HIPPO通路，降低下游靶點蛋白YAP的表達，下調腫瘤增殖和抗凋亡基因的表達，從而導致細胞凋亡[10]。但JuA在中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用未見報道。本課題組前期試驗證實，JuA可抑制人神經膠質瘤U251細胞的增殖，提示JuA可能在惡性神經膠質瘤的治療中發(fā)揮潛在的作用。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是一種自然現象，存在于多細胞生物的生長、發(fā)育和死亡等過程中。細胞通過啟動凋亡程序，能夠及時清除機體內的損傷或突變細胞，以維持組織器官和內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[11]。細胞凋亡過程不可逆轉，凋亡發(fā)生時，細胞形態(tài)變化主要表現為細胞皺縮、染色質凝固、DNA斷裂、凋亡小體形成等，而分子水平則涉及諸多信號轉導通路的改變[12]。腫瘤細胞的特征之一是缺乏程序性的細胞死亡過程。Hickman等于1992年首次提出可以將誘導腫瘤細胞凋亡作為腫瘤治療研究的主要目標和手段[13]。隨后誘導腫瘤細胞凋亡成為腫瘤治療研究的新方向。

本試驗首先通過MuseTM細胞分析儀檢測，確定了JuA預處理可引起U251膠質瘤凋亡細胞數增加，并證實JuA引起的U251膠質瘤細胞凋亡具有濃度依賴效應，即JuA濃度越高，對U251膠質瘤細胞的凋亡誘導作用越明顯；進一步觀察發(fā)現，JuA可引起U251膠質瘤細胞的形態(tài)學改變；Hoechest 33258和AO/EB染色結果均顯示，JuA處理的U251膠質瘤細胞細胞核發(fā)生凝固、濃縮、邊集和碎片化等典型細胞凋亡改變。上述試驗結果均提示，JuA抑制U251細胞增殖的機制可能是通過促進細胞凋亡而實現的，但是，JuA引起U251細胞凋亡的具體分子機制有待進一步深入研究。