陸祖瑜 ， 濮春娟 ， 劉 莎 ， 羅鈺枝 ， 陳美蘭

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 ， 北京 東城 100007)

隨著畜禽飼料禁抗令的全面推進(jìn)，尋找更為安全高效的抑菌殺菌藥物迫在眉睫。天然中草藥因具有抗菌范圍廣、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)成為動(dòng)物替抗藥研究的焦點(diǎn)。大量的文獻(xiàn)表明，清熱解毒類中藥在細(xì)菌感染治療中表現(xiàn)出很好的療效，如清熱藥黃芩、黃連、黃柏能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和嗜酸乳桿菌的增殖[1]。中藥(Traditional Chinease medicine,TCM)的許多有效成分都具有抗菌活性，黃酮類如黃芩苷，生物堿類如黃連小檗堿，有機(jī)酸類如綠原酸，以及揮發(fā)油成分等都具有顯著的抑菌殺菌作用[2]?，F(xiàn)代中藥企業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生了大量的中藥廢棄物——中藥渣、中藥材非藥用部位等，清熱類中藥廢棄物大都保留多種抗菌抑菌活性成分，也極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。例如，楊璇璇等[3]優(yōu)化提取工藝,從1 g苦參渣中提取到5.632 mg苦參堿；李靜等[4]研究發(fā)現(xiàn)，忍冬根、藤、葉和果都含有抗菌活性成分——綠原酸?；诖耍驹囼?yàn)以7種中藥廢棄物和3種中藥復(fù)方為材料，研究它們對(duì)大腸埃希菌、腸炎沙門菌和金黃色葡菌球菌的體外抑制作用，為畜禽細(xì)菌感染的防治以及中藥廢棄物的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 中藥復(fù)方1(金銀花、連翹、黃芩等)、中藥復(fù)方2(地錦草、石膏、梔子等)、中藥復(fù)方3(黃連、石膏、苦參等)、牛黃上清藥渣(黃連、黃柏、黃芩等17種藥渣)、連花清瘟藥渣(連翹、金銀花、炙麻黃等13種藥渣)、銀翹藥渣(金銀花、連翹、薄荷等9種藥渣)、清開(kāi)靈藥渣(梔子、板藍(lán)根、金銀花)、苦參藥渣、忍冬藤、忍冬葉，中藥復(fù)方和中藥廢棄物均來(lái)自河北森隆藥業(yè)。中藥渣來(lái)自以嶺藥業(yè)和白云山明興制藥有限公司。氨芐西林粉末(>98%)，購(gòu)自北京華越洋生物公司，批號(hào)：BC2008K。頭孢噻肟鈉粉末(>98%),購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,批號(hào)：FA29BA0009。氨芐西林藥敏紙片和頭孢噻肟鈉藥敏紙片，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂糖，均購(gòu)自英國(guó)OXOID生物公司。NaCl，購(gòu)自天津鼎盛鑫化工有限公司。

1.2 供試菌種 大腸埃希菌(CVCC3959)、腸炎沙門菌(CVCC3949)、金黃色葡萄球菌(CVCC4098)凍干粉，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 方法

1.3.1 藥液制備 中藥復(fù)方/中藥廢棄物粉碎成粗粉。分別取40 g藥粉，1∶10(m/V)加入400 mL 70%乙醇-水溶液浸泡過(guò)夜，超聲提取2次，合并濾液。旋蒸濾液濃縮至1 g/mL。濃縮液過(guò)0.22 μm濾膜除菌，放置4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 菌液制備 吸取少量培養(yǎng)基溶解菌凍干粉，吸取40 μL菌液到培養(yǎng)基中，200 r/min,37 ℃培養(yǎng)24 h復(fù)活菌種。吸取菌液平板劃線分離單菌落。挑取單菌落到液體培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)6 h。在對(duì)數(shù)期將菌液稀釋到106CFU/mL，備用。

1.3.3 抑菌圈檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[4]將直徑6 mm空白藥敏紙片浸泡在1 g/mL中藥提取液中，待浸透后取出，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干備用。吸取少量菌液均勻涂布平板，待菌液稍吸收后取含藥紙片貼在平板上。每個(gè)平板均勻貼2張含藥紙片及1張對(duì)照藥物藥敏紙片(氨芐西林或頭孢噻肟鈉)。紙片間圓心距要大于3 cm。每組設(shè)置3個(gè)平行。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后分別測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

抑菌強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，無(wú)抑菌圈為耐藥。

1.3.4 最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[5]通過(guò)二倍稀釋法測(cè)中藥最低抑菌濃度。取96孔微量板，在第1～11孔加入100 μL培養(yǎng)基，第1孔加入 100 μL藥液，混勻后吸取100 μL到第2孔，重復(fù)操作，第8孔棄100 μL。最終1～8孔濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.81 mg/mL和3.91 mg/mL。第9孔為陰性對(duì)照，加100 μL培養(yǎng)基。第10孔為藥物對(duì)照，加入氨芐西林(金黃色葡萄球菌的藥物對(duì)照)或頭孢噻肟鈉。每個(gè)藥物設(shè)置3個(gè)平行。每孔加入10 μL菌液，置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基肉眼可見(jiàn)澄清即認(rèn)為該濃度對(duì)相應(yīng)菌種有抑菌作用。

藥物抑菌強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)MIC<7.81 mg/mL為高度敏感；當(dāng)7.81 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL為中度敏感；MIC>250 mg/mL為不敏感。

1.3.5 最低殺菌濃度(MBC)檢測(cè) 挑選出對(duì)應(yīng)中藥抑菌MIC以及比MIC高1倍濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布，每組濃度設(shè)置3個(gè)平行。置于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。平板內(nèi)菌落數(shù)≤5可認(rèn)為該濃度能有效殺菌。

2 結(jié)果

2.1 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)3種病原菌的抑菌圈檢測(cè) 不同種類的中藥廢棄物以及中藥復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球圖和其他2種病原菌的抑菌作用有明顯差異。對(duì)于金黃色葡萄球菌，3種中藥廢棄物和3種中藥復(fù)方都具有明顯的抑菌作用，但是抑菌作用強(qiáng)度不同，結(jié)果見(jiàn)表1。其中中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方3、銀翹藥渣對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均>20 mm，為金黃色葡萄球菌極敏藥物。中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣的抑菌圈直徑分別為17.11 mm和18.17 mm，介于15～19 mm，為金黃色葡萄球菌高敏藥物。連花清瘟的抑菌圈直徑為13.58 mm，介于10～14 mm，表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌中敏藥物。而忍冬藤、忍冬葉、苦參渣、清開(kāi)靈渣對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯抑菌圈。另外，對(duì)照藥物氨芐西林對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈的平均直徑為41.06 mm，為金黃色葡萄球菌極敏藥物。而對(duì)于大腸埃希菌，只有中藥復(fù)方1對(duì)大腸埃希菌有明顯抑菌透明圈，平均抑菌圈直徑為13.89 mm，這表示大腸埃希菌對(duì)該藥中度敏感。然而，10種藥物對(duì)于腸炎沙門菌都沒(méi)有抑菌透明圈。

表1 金黃色葡萄球菌抑菌圈檢測(cè)

另外，對(duì)照藥氨芐西林對(duì)于大腸埃希菌和腸炎沙門菌也沒(méi)有明顯的抑菌透明圈，而另一種對(duì)照藥頭孢噻肟鈉對(duì)上述2種病原菌具有明顯的抑菌圈，抑菌圈大小分別為25.18 mm和38.60 mm，為極敏藥物。該結(jié)果表明大腸埃希菌和腸炎沙門菌對(duì)于氨芐西林具有耐藥性，而對(duì)頭孢噻肟鈉極敏。因此在進(jìn)行大腸埃希菌和腸炎沙門菌的MIC和MBC試驗(yàn)時(shí)采用頭孢噻肟鈉作為對(duì)照藥物。

2.2 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)3種病原菌的MIC 結(jié)果表明不同種類中藥復(fù)方以及中藥廢棄物對(duì)于金黃色葡萄球菌和其他2種病原菌的最低抑菌濃度有差異(表2)。對(duì)于金黃色葡萄球菌，3種中藥復(fù)方和6種中藥廢棄物(除清開(kāi)靈藥渣外)都能有效抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，但是MIC不同。其中牛黃上清、銀翹、連花清瘟藥渣和中藥復(fù)方1的MIC值為3.91 mg/mL，說(shuō)明金黃色葡萄球菌對(duì)這4種藥物高度敏感。其余6種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌MIC值均在7.81～250 mg/mL，屬于中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方2>中藥復(fù)方3>忍冬藤>忍冬葉=苦參>清開(kāi)靈藥渣。

表2 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)3種病原細(xì)菌最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

對(duì)于大腸埃希菌，3種中藥復(fù)方和4種中藥廢棄物有中度抑制該菌生長(zhǎng)的作用。抑菌有效的7種藥物對(duì)大腸埃希菌MIC值在62.5～250 mg/mL，為中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方1>中藥復(fù)方3>中藥復(fù)方2=牛黃上清藥渣=銀翹藥渣=清開(kāi)靈藥渣=忍冬藤。連花清瘟藥渣、忍冬葉和苦參渣MIC值均≥500 mg/mL,抑菌無(wú)效。

針對(duì)腸炎沙門菌，4種中藥廢棄物以及中藥復(fù)方1對(duì)該菌有中度抑菌作用。中藥復(fù)方1和忍冬藤等4種中藥廢棄物對(duì)腸炎沙門菌的MIC值在125～250 mg/mL，為腸炎沙門菌中度敏感藥物，抑菌強(qiáng)度(MIC值大小)：中藥復(fù)方1=忍冬藤>牛黃上清藥渣=銀翹藥渣=清開(kāi)靈藥渣。中藥復(fù)方2、中藥復(fù)方3、連花清瘟藥渣、忍冬葉和苦參渣MIC值均≥500 mg/mL，抑菌無(wú)效。

2.3 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)3種病原菌的MBC 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著殺菌作用，但對(duì)大腸埃希菌和腸炎沙門菌殺菌作用不佳，結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)中10種藥物對(duì)金黃色葡萄球菌都有不同程度的殺菌效果。中藥復(fù)方1、牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、中藥復(fù)方2和連花清瘟藥渣對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC值在3.91～7.81 mg/mL，為金黃色葡萄球菌強(qiáng)效殺菌藥物。10種藥物的殺菌強(qiáng)度(MBC值)：中藥復(fù)方1=銀翹藥渣>中藥復(fù)方2=連花清瘟藥渣>牛黃上清藥渣>苦參渣>忍冬葉>清開(kāi)靈藥渣。

表3 3種中藥復(fù)方和7種中藥廢棄物對(duì)3種細(xì)菌最低殺菌濃度Table 3 Minimum bactericidal concentration of 3 TCM compounds and 7 TCM residues to 3 pathogenic bacteria (mg/mL)

10種藥物對(duì)大腸埃希菌和腸炎沙門菌的殺菌作用較弱。對(duì)于大腸埃希菌，中藥復(fù)方1和5種中藥廢棄物(牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、忍冬葉、忍冬藤和清開(kāi)靈藥渣)MBC值均為500 mg/mL。然而，連花清瘟藥渣、中藥復(fù)方2、中藥復(fù)方3和苦參渣的MBC值在500 mg/mL以下，沒(méi)有殺大腸埃希菌作用。對(duì)于腸炎沙門菌，中藥復(fù)方1殺菌效果最好，MBC值為250 mg/mL。而牛黃上清藥渣、銀翹藥渣、中藥復(fù)方2和清開(kāi)靈藥渣的MBC值均為500 mg/mL,說(shuō)明這4種藥物在高濃度下也能有效殺菌。而連花清瘟藥渣、中藥復(fù)方3、忍冬葉、忍冬藤、苦參渣的MBC值為500 mg/mL，也沒(méi)有表現(xiàn)出殺腸炎沙門菌作用。

3 討論

大腸埃希菌、腸炎沙門菌和金黃色葡萄球菌發(fā)病率高、致病性強(qiáng)，對(duì)畜禽動(dòng)物的生命健康有很大的威脅，同時(shí)直接影響到食品安全。相比于抗生素，清熱類中藥治療細(xì)菌感染更為安全有效。本試驗(yàn)結(jié)果表明，9種藥物(除清開(kāi)靈藥渣外)都對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌和殺菌作用，其中中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣、連花清瘟藥渣和銀翹藥渣對(duì)金黃色葡萄球菌為高度敏感藥物。因此中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方2、牛黃上清藥渣、連花清瘟藥渣和銀翹藥渣都可進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)成用于防治由金黃色葡萄球菌引起的家禽、家畜疾病的藥物。然而，僅有中藥復(fù)方1和中藥復(fù)方3對(duì)大腸埃希菌表現(xiàn)為中度敏感；僅有忍冬藤和中藥復(fù)方1表現(xiàn)為腸炎沙門菌中度敏感。因此為了篩選出對(duì)大腸埃希菌和腸炎沙門菌表現(xiàn)為高敏感的中藥復(fù)方或中藥廢棄物，我們將選擇更多的中藥復(fù)方和中藥廢棄物來(lái)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

大部分清熱類中藥本身具有廣譜抑菌作用。由于提取工藝和成本限制，藥渣會(huì)殘留部分藥效成分，再次提取依然能發(fā)揮出不同程度的抑菌作用。史利克等[7]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連花清瘟浸膏在低濃度(2～8 mg/mL)對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌作用，在128 mg/mL下抑制大腸埃希菌生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與史利克等[7]的結(jié)果相符，連花清瘟藥渣在低濃度(7.81 mg/mL)下可以對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，在高濃度(500 mg/mL)下對(duì)腸炎沙門菌和大腸埃希菌也有抑菌作用?？赡苁且?yàn)檫B花清瘟本身含有多種抗炎抑菌作用成分，如薄荷腦、綠原酸、連翹苷和大黃黃酮類等[8]，提取后的連花清瘟藥渣也保留了部分的抑菌成分。而另一種清熱燥濕中藥——苦參，也含有多種抑菌活性成分，苦參總生物堿、苦參黃酮等對(duì)多種致病菌有一定的抑制作用[9]，本試驗(yàn)結(jié)果也表明苦參渣對(duì)金黃色葡萄球菌具有中度抑菌作用。

忍冬藥用部位忍冬花通常被認(rèn)為是藥效成分積累最多的植物部位，但同一藥用植物上非藥用部位也有含量稍低的相同藥效成分，也能在一定程度上發(fā)揮出藥效[10]。金銀花、忍冬葉、忍冬藤都含有抑菌成分如綠原酸和黃酮類，但抑菌活性成分在忍冬不同部位的濃度不同[11]。李瑞國(guó)等[12]研究發(fā)現(xiàn),忍冬藤提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)于忍冬葉，而對(duì)大腸埃希菌的抑菌活性不及忍冬葉。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，忍冬葉和忍冬藤都有抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的作用。但忍冬藤對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑制作用都強(qiáng)于忍冬葉。本試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于前人的結(jié)果，可能是因?yàn)樵囼?yàn)采用的提取方法不同導(dǎo)致提取效率有差異，本次采用的提取方法可能對(duì)忍冬藤有效成分的提取效率更優(yōu)。

大部分中藥非藥用部位和中藥渣目前主要是當(dāng)作生活垃圾進(jìn)行焚燒、填埋和固定區(qū)域堆放處理。這不僅要投入大量的資金，占用了大量的土地資源，還污染了土地及地下水，也造成中藥廢棄物資源的浪費(fèi)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，7種清熱類中藥非藥用部位和中藥藥渣仍保留部分藥效成分，依然可以發(fā)揮出藥效價(jià)值，具有開(kāi)發(fā)成動(dòng)物替抗藥物的潛力。本試驗(yàn)可為將來(lái)利用中藥廢棄物開(kāi)發(fā)中藥抗生素提供思路和指導(dǎo)。另外，為了進(jìn)一步將此類藥物開(kāi)發(fā)成動(dòng)物替抗藥物，還需要深入考察其在染病畜禽體內(nèi)的作用機(jī)制及安全性。