王 雪 ， 周 航 ， 胡人閣 ， 孔令聰，2 ， 馬紅霞

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 吉林 長春 130118 ； 2. 吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 吉林 長春 130118 ； 3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 , 吉林 長春 130118 ； 4. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心 ， 吉林 長春 130118)

沙門菌屬(Salmonella)包含多達(dá)6個(gè)亞種和2 600多個(gè)血清型，其中的致病性沙門菌不僅與動(dòng)物疾病密切相關(guān)，而且可以感染人類引起人獸共患病[1]。據(jù)歐盟最新報(bào)告顯示，9 061例人類食源性病例中有1 067例與沙門菌病有關(guān)，甚至導(dǎo)致128人死亡(占所有食源性病例的0.25%)[2]。同時(shí)，傷寒沙門菌引發(fā)的腸炎僅在東南亞地區(qū)每年便造成多達(dá)60萬人死亡[3]?？傊?，沙門菌感染所引起的疾病給公共衛(wèi)生安全帶來了極大的威脅，深入研究沙門菌致病機(jī)制對(duì)控制該病至關(guān)重要。

致病性沙門菌通過由Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)組成的復(fù)雜機(jī)制傳遞一組特殊效應(yīng)物，這些效應(yīng)子協(xié)同操縱宿主細(xì)胞的多個(gè)信號(hào)通路來驅(qū)動(dòng)病原體內(nèi)化，使其侵入非吞噬性腸上皮細(xì)胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)，這在沙門菌的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。

沙門菌毒力島1(Salmonellapathogenicity island 1,SPI-1)已經(jīng)被證明可以編碼T3SS-1，這一分子注射器可以直接將一組毒力效應(yīng)蛋白導(dǎo)入宿主細(xì)胞。SPI-1位于染色體第63位，由大約40個(gè)基因組成，包括39個(gè)編碼T3SS-1及其伴侶蛋白和效應(yīng)蛋白的基因，以及一些用于調(diào)控SPI-1毒力基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]。雖然入侵效應(yīng)物的生化活性已被廣泛描述，但它們?cè)谌肭诌^程中發(fā)揮的多重作用并未被充分發(fā)掘。本文對(duì)SPI-1在沙門菌入侵宿主細(xì)胞中的作用、調(diào)控機(jī)制和效應(yīng)蛋白分類進(jìn)行綜述。

1 SPI-1的作用

SPI-1在沙門菌與宿主細(xì)胞的相互作用中至關(guān)重要，其編碼的T3SS-1介導(dǎo)沙門菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲[5]。T3SS核心部件是出口裝置和針狀復(fù)合物。出口裝置由蛋白質(zhì)InvA、SpaP、SpaQ、SpaR和SpaS組成，是針狀復(fù)合物基部的起始結(jié)構(gòu)，對(duì)基部的組成和穩(wěn)定性至關(guān)重要，并使針狀復(fù)合物具有分泌效應(yīng)因子的能力[6]。針狀復(fù)合物由跨越細(xì)菌包膜的多環(huán)圓柱形基部和從細(xì)菌外表面突出的針狀延伸物組成。其中，多環(huán)圓柱形基部由3種等摩爾量蛋白質(zhì)構(gòu)成：InvG構(gòu)成外環(huán)，PrgH和PrgK形成剩余結(jié)構(gòu)[7]。針狀延伸物由胞外針、針尖復(fù)合物和易位子組成，其中PrgI是胞外針結(jié)構(gòu)主要組成部分。InvJ控制針段的長度。PrgJ在基部形成一個(gè)固定針的內(nèi)桿，其在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)和宿主細(xì)胞膜之間形成導(dǎo)管，將細(xì)菌的效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞[8]。針尖復(fù)合物由針尖蛋白SipD與針尖亞基PrgI相互作用形成，其能有效控制效應(yīng)蛋白的分泌，調(diào)節(jié)沙門菌入侵宿主細(xì)胞[9]。在沙門菌與宿主細(xì)胞接觸后，SipD與轉(zhuǎn)位蛋白SipB、SipC形成一個(gè)易位子的平臺(tái)，易位子在宿主細(xì)胞膜上形成孔，使效應(yīng)蛋白直接進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)沙門菌侵襲宿主細(xì)胞[10]。這些易位子由沙門菌SPI-1編碼，其在沙門菌與宿主細(xì)胞的接觸和侵襲以及哺乳動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的定植過程中發(fā)揮重要作用。

除了入侵外，SPI-1還參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、干預(yù)宿主反應(yīng)、逃避監(jiān)控以利于沙門菌的生存[11]。研究發(fā)現(xiàn)，SPI-1編碼的蛋白質(zhì)參與沙門菌感染宿主細(xì)胞的復(fù)雜免疫反應(yīng)。Pavlova等[12]用沙門菌及其SPI-1缺失突變體分別感染豬肺泡巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明SPI-1編碼的T3SS-1不僅用于細(xì)胞侵襲，而且用于抑制巨噬細(xì)胞早期促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，包括IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-23α、GM-CSF和IL-18。此外，Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)SPI-1參與巨噬細(xì)胞MHC-II下調(diào)和M2表型極化。Chaudhuri等[14]通過對(duì)感染沙門菌小鼠腦部不同部位的細(xì)菌濃度分析發(fā)現(xiàn)，沙門菌SPI-1和外膜蛋白A基因提高了血腦屏障的滲透性，促使沙門菌穿過血腦屏障到達(dá)不同的腦組織，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染并引發(fā)腦損傷。

2 沙門菌SPI-1 T3SS-1效應(yīng)蛋白

許多革蘭陰性細(xì)菌病原體運(yùn)用T3SS將其自身蛋白質(zhì)(即效應(yīng)蛋白)注入到宿主細(xì)胞中，以調(diào)節(jié)某些細(xì)胞功能。截至目前，在沙門菌中已鑒定出許多SPI-1效應(yīng)蛋白，這些效應(yīng)蛋白在沙門菌感染過程中發(fā)揮多種作用，包括參與宿主細(xì)胞骨架的重排、免疫細(xì)胞募集、細(xì)胞代謝以及宿主炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[15]。SPI-1效應(yīng)因子主要在沙門菌處于細(xì)胞外并允許侵入非吞噬細(xì)胞時(shí)起作用，SPI-2則在內(nèi)化后被激活并起到促進(jìn)含沙門菌空泡(Salmonellacontaining vacuole，SCV)發(fā)育的作用。其中編碼T3SS-1的SPI-1效應(yīng)蛋白及其功能見表1。

表1 沙門菌分泌效應(yīng)蛋白及其在疾病中的作用

2.1 AvrA AvrA是乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的一員，全長33 kDa，在沙門菌入侵初期被轉(zhuǎn)位至腸上皮細(xì)胞，其在抑制炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖等方面發(fā)揮著重要作用。雖然沙門菌感染細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡并激活促炎反應(yīng)，但研究顯示AvrA蛋白抑制了這2種宿主反應(yīng)，可能是為避免宿主適應(yīng)性免疫而建立了一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)生態(tài)位[16]。主要表現(xiàn)為通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)來阻斷炎癥前體NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活并抑制細(xì)胞凋亡。Wu等[17]發(fā)現(xiàn)，缺乏AvrA的沙門菌可引起腸道炎癥增加，導(dǎo)致系統(tǒng)性細(xì)胞因子反應(yīng)加強(qiáng)，并促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)加劇上皮外巨噬細(xì)胞的凋亡，結(jié)果表明AvrA可能通過抑制JNK來調(diào)節(jié)被感染巨噬細(xì)胞的存活，阻止巨噬細(xì)胞的死亡并降低細(xì)菌傳播速度，進(jìn)而建立一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)病原體。此外，AvrA是一種去泛素酶，能夠去除核因子κB通路(Nuclear factor-κB,NF-κB)抑制蛋白IκBα和β-catenin的泛素，從而阻斷NF-κB通路激活，抑制宿主的炎癥反應(yīng)。Lu等[18]發(fā)現(xiàn)，AvrA缺陷的沙門菌菌株加速IκBα和β-連環(huán)蛋白降解，促進(jìn)IL-6分泌、c-myc和cyclin D1 的表達(dá)，結(jié)果表明AvrA在菌株中的表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)，增加β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致腫瘤形成。

2.2 Sips 沙門菌入侵蛋白(Salmonellainvasion protein,Sips)分為4類，即Sips A～D。這些Sips輸出并轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞質(zhì)膜或胞漿中，在SPI-1效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。

2.2.1 SipA SipA是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，通過影響不同階段細(xì)胞膜褶皺的形成和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排來提高沙門菌進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率。研究表明SipA在沙門菌入侵部位調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白分子的濃度、聚合和穩(wěn)定性并提高宿主細(xì)胞絲束蛋白的綁定活性[19]。同時(shí)SipA還是雙重功能效應(yīng)蛋白，McIntosh等[20]用熒光小標(biāo)簽phiLOV標(biāo)記SipA，結(jié)果表明其在腸上皮細(xì)胞中促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合并激活宿主凋亡介質(zhì)Caspase-3酶，使Caspase-3在宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答中發(fā)揮多種作用。

2.2.2 SipB、SipC和SipD SipB、SipC和SipD是參與SPI-1 T3SS針狀復(fù)合物形成的轉(zhuǎn)位蛋白，促進(jìn)了效應(yīng)蛋白在宿主細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)。已有研究表明這些轉(zhuǎn)位蛋白可能在宿主細(xì)胞膜上形成一個(gè)通道，進(jìn)而促使T3SS效應(yīng)蛋白通過宿主細(xì)胞膜。其中，SipB參與沙門菌誘導(dǎo)的Caspase-1依賴性細(xì)胞凋亡，并通過蛋白酶Caspase-1激活I(lǐng)L-18，從而保障沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活[21]。SipC作用靶點(diǎn)是F-肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白是參與病原體內(nèi)化和促進(jìn)沙門菌入侵的重要因子。SipD的N-末端區(qū)域在轉(zhuǎn)錄和翻譯后促進(jìn)效應(yīng)物的分泌和功能。

2.3 SptP 沙門菌蛋白酪氨酸磷酸酶(Salmonellaprotein tyrosine phosphatase,SptP)是一種模塊化蛋白，由3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：伴侶結(jié)合結(jié)構(gòu)域、間隙結(jié)構(gòu)域和酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域。SptP參與介導(dǎo)感染后宿主細(xì)胞骨架的恢復(fù)，并通過調(diào)節(jié)絨毛蛋白磷酸化直接逆轉(zhuǎn)了由沙門菌其他效應(yīng)物誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架改變。同時(shí)，為保證SptP最有效分泌，需要與位于其上游的伴侶蛋白SicP相互作用達(dá)到翻譯的耦合[22]。Humphreys等[23]對(duì)SptP在感染細(xì)胞中壽命的進(jìn)行觀察，結(jié)果表明SptP介導(dǎo)含纈酪肽蛋白質(zhì)的去磷酸化，并促進(jìn)細(xì)胞膜融合和蛋白降解，增強(qiáng)了SCV中的病原體復(fù)制。此外，Kawakami等[24]發(fā)現(xiàn)SptP抑制肥大細(xì)胞的脫粒和激活，從而阻礙早期先天免疫反應(yīng)并使細(xì)菌得以傳播。

2.4 Sops 沙門菌外蛋白(Salmonellaouter proteins,Sops)是由SopA、SopB、SopD、SopD2、SopE和SopE2組成的一類效應(yīng)蛋白。Sops參與控制不同階段多形核白細(xì)胞內(nèi)流和細(xì)胞骨架重排，有助于沙門菌入侵，導(dǎo)致炎癥和腹瀉。

2.4.1 SopA SopA可促進(jìn)由沙門菌感染引起的炎癥。同時(shí)，SopA穩(wěn)定性和易位需要分子伴侶InvB。InvB通常結(jié)合在SopA的N-端區(qū)域，在保持效應(yīng)器分泌能力及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮作用[25]。此外，SopA與宿主泛素E3連接酶HsRMA1[又名環(huán)指蛋白5(RNF5)]相互作用誘發(fā)炎癥。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)SopA通過HsRMA1介導(dǎo)的泛素化途徑被泛素化并降解。沙門菌通過SopA泛素化成功從SCV逃逸至腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制并導(dǎo)致了腹瀉。另有研究表明，SopA直接介導(dǎo)泛素連接酶E3中三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(Tripartite motif,TRIM)56和TRIM65的泛素化以及蛋白酶體降解，從而調(diào)節(jié)固有免疫[27]。

2.4.2 SopB/SigD SopB/SigD是一種肌醇磷酸酶，抑制磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)依賴性信號(hào)傳導(dǎo)，并參與氯化物分泌以及中性粒細(xì)胞募集。研究表明它們通過阻斷磷酸肌醇信號(hào)通路和誘導(dǎo)蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)活化來介導(dǎo)毒力。Rodríguez-Escudero等[28]發(fā)現(xiàn)，SigD在體外將多種可溶性肌醇聚磷酸鹽和肌醇磷脂脫磷酸，在體內(nèi)將肌醇1,3,4,5,6五磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇1,4,5,6四磷酸，進(jìn)而刺激肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排并促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)化。García-Gil等[29]發(fā)現(xiàn)，SopB激活PI3K-Akt-YAP通路并調(diào)節(jié)B細(xì)胞中IL-1的生成。同時(shí)，SopB可誘導(dǎo)IL-10分泌，并阻斷IL-6與IL-1β的產(chǎn)生，這將促進(jìn)抗炎環(huán)境的形成。此外，Drecktrah等[30]通過對(duì)亞硝酸鹽濃度的測(cè)量來量化一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase,iNOS)的活性，結(jié)果表明SopB刺激一氧化氮(Nitric oxide,NO)的產(chǎn)生用以介導(dǎo)毒力。

2.4.3 SopD/SopD2 SopD影響多種信號(hào)傳導(dǎo)及蛋白質(zhì)間相互作用，參與沙門菌的系統(tǒng)性毒力作用并導(dǎo)致胃腸炎。在沙門菌入侵期間，SopD與SopB 共同作用導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜裂變。此外，SopD和SopD2共同作用促進(jìn)沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并與SCV有關(guān)。其中，T3SS-2效應(yīng)子SopD2有助于沙門菌誘導(dǎo)的絲狀體形成，并抑制囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和從SCV向外延伸的小管形成，是SCV影響不穩(wěn)定性的主要因素[31]。

2.4.4 SopE SopE是一種Rho-GTPase交換因子，可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的快速重排、導(dǎo)致細(xì)胞膜皺褶、參與病原體巨胞飲作用并促進(jìn)細(xì)菌侵襲。研究表明，SopE短暫定位于SCV早期并參與沙門菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制[32]。SopE2與SopE同源，其作用機(jī)制與SopE相似。此外，SopE可通過蛋白酶體介導(dǎo)的途徑快速降解，導(dǎo)致Cdc42和Rac1失活，從而逆轉(zhuǎn)SopB-、SopE-和SopE2-信號(hào)通路。López-Garrido等[33]發(fā)現(xiàn)，在感染后第4天sopE+鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)菌株在小鼠腸道中的含量高于同基因sopE突變體，且S.typhimurium經(jīng)編碼SopE的噬菌體裂解后，可誘導(dǎo)宿主在腸道內(nèi)產(chǎn)生iNOS，通過硝酸鹽呼吸促進(jìn)了腸腔內(nèi)S.typhimurium的生長。說明通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得一種毒力因子可以增加病原體的代謝適應(yīng)度，從而促進(jìn)沙門菌的生長。

3 展望

沙門菌是引起食源性腸胃炎的重要病原體，是人類和包括鳥類在內(nèi)動(dòng)物感染人獸共患傳染病的罪魁禍?zhǔn)?。因此，沙門菌感染是全世界公眾健康、動(dòng)物和食品工業(yè)的亟待解決一個(gè)主要問題。其中，沙門菌毒力島SPI-1編碼的T3SS-1系統(tǒng)可將效應(yīng)物直接轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)沙門菌入侵宿主細(xì)胞至關(guān)重要。雖然SPI-1效應(yīng)因子大多已被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)效應(yīng)因子作用機(jī)制以及各個(gè)效應(yīng)因子間的協(xié)同作用仍有待挖掘，且以其毒力作用為靶向應(yīng)用于對(duì)沙門菌感染的控制將有助于藥物的研發(fā)。目前，將腸炎沙門菌SPI-1編碼的毒力蛋白作為疫苗以預(yù)防禽類腸炎沙門菌的研究方興未艾。同時(shí)，SPI-1編碼T3SS-1在抗腫瘤方面的研究也有所突破，減毒沙門菌應(yīng)用于腫瘤的治療中指日可期。為此，深入研究SPI-1及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將有助于我們進(jìn)一步了解沙門菌致病機(jī)制，并對(duì)新型疫苗及抗革蘭陰性菌藥物的研發(fā)具有重要意義。