劉名安, 李輝嚴(yán), 李建明*, 柳玉紅

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510000； 2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 病理科， 廣東 深圳 518101; 3.中山大學(xué) 孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510120)

CRISPR序列最早是1987年在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)的，但是直到2007年它們對(duì)噬菌體的保護(hù)作用才被證實(shí)[1-2]。CRISPR 基因座存儲(chǔ)了病原菌的基因信息，是微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分。在CRISPR之前，基因編輯系統(tǒng)包括鋅指核酸酶(ZFNs)系統(tǒng)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALENs)系統(tǒng)。由于其相對(duì)簡(jiǎn)單和適應(yīng)性，CRISPR已迅速成為最流行的基因組工程方法。2013年，Cong等[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在人類和小鼠細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)的基因編輯，并構(gòu)建了可同時(shí)靶向多個(gè)位點(diǎn)的基因編輯系統(tǒng)，這極大地推進(jìn)了基因編輯技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

微衛(wèi)星(micro satellite，MS)是基因組中一種小于10 bp的簡(jiǎn)單重復(fù)序列[4]，又叫短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat，STR)，是一類呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記，用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷；這些簡(jiǎn)單重復(fù)序列在DNA復(fù)制過程中容易出現(xiàn)“鏈滑”現(xiàn)象，導(dǎo)致重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)波動(dòng)，即重復(fù)單元的插入與刪除，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定的形成。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(micro satellite instability，MSI)是由DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失引起的一種超可變表型[5]。錯(cuò)配修復(fù)蛋白系統(tǒng)由一系列酶組成，主要包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白，這些酶檢測(cè)S期DNA復(fù)制錯(cuò)誤并加以修正，保證了DNA復(fù)制的保真性[6-8]。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)功能受損，無法修復(fù)DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)錯(cuò)誤，這種錯(cuò)誤逐漸在基因組DNA序列上積累，形成了突變負(fù)荷的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，堿基突變積累程度高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤有著更顯著的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度和免疫檢查點(diǎn)阻斷劑療效[10-11]。檢測(cè)腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)可以預(yù)測(cè)腫瘤患者抗腫瘤免疫治療的反應(yīng)，且越來越多的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑被批準(zhǔn)用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者的抗腫瘤免疫治療[12-15]。但是，僅有一小部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者在免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的治療方案中受益[16]，微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤廣泛預(yù)后的具體機(jī)制尚未完全明了。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建MLH1基因敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定鼠源性結(jié)腸癌細(xì)胞Mc38和乳腺癌細(xì)胞4T1兩種細(xì)胞模型，為后續(xù)深入研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤在抗腫瘤免疫治療過程中的作用機(jī)制提供工具和手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

CRISPR/Cas9骨架質(zhì)粒lentiCRISPRv2(Plasmid #52961)，慢病毒包裝骨架質(zhì)粒pMD2.G(Plasmid #12259)和psPAX2(Plasmid #12260)，鼠源性結(jié)直腸癌細(xì)胞系Mc38、乳腺癌細(xì)胞系4T1由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院李建明教授課題組提供。

1.1.2 主要試劑

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、RIPA裂解液(強(qiáng))(碧云天生物技術(shù)有限公司)、PMSF磷酸酶抑制劑(50×)(碧云天生物技術(shù)有限公司)、PierceTMBCA Protein Assay(賽默飛世爾科技公司)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(碧云天生物技術(shù)有限公司)、蛋白marker(賽默飛世爾科技公司)、Antibody to GAPDH(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、HRP標(biāo)記抗兔IgG(美國(guó)Jaskson公司)、HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(美國(guó)Jaskson公司)、Ra EPR38bbit monoclonal to MLH1(英國(guó)abcam公司)、Cas9 (S. pyogenes) (D8Y4K) Rabbit mAb(英國(guó)abcam公司)、DL15000 DNA Marker(3582A)、GelRed無毒核酸染料(41003)、2 × Taq Master Mix (Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、Polybrene聚凝胺(H8761)、嘌呤霉素(0219453925)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。

1.1.3 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)、純水儀(默克生命科學(xué)有限公司)、超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、小型低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)、金屬煮樣器、制冰機(jī)(Scotsman公司)、流式分選儀、水浴鍋、電子天平(Mettler Toledo公司)、光學(xué)顯微鏡、水平搖床(Kylin-Bell公司)、高壓滅菌鍋、電泳儀(BioRad公司)、瓊脂糖水平電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(Tanon公司)、酶標(biāo)儀、蛋白印跡成像系統(tǒng)(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 SgRNA序列設(shè)計(jì)

利用 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索鼠源性MLH1基因(ID：17350)信息。利 用 Zhang lab 實(shí) 驗(yàn) 室 網(wǎng) 站(https://zlab.bio/guidedesign-resources)設(shè)計(jì)特異性靶向MLH1基因的SgRNA序列；根據(jù)SgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站計(jì)算得分，選取兩條特異性靶向MLH1基因的SgRNA序列，SgRNA1：ATTGGCAAGCATAAGCCATG，SgRNA2：GGGCACCCTGATCACGGTGA。其中，SgRNA1序列特異性靶向MLH1基因的第四號(hào)外顯子，SgRNA2序列特異性靶向MLH1基因的第五號(hào)外顯子末端部分堿基序列及其后面部分內(nèi)含子堿基序列(圖1)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列。

圖1 MLH1基因敲除示意圖Figure 1 Schematic diagram of MLH1 gene knockout strategy

1.2.2 lentiCRISPRv2-SgRNA載體的構(gòu)建

使用BsmBⅠ限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒lentiCRISPRv2并切膠回收。合成的寡核苷酸單鏈SgRNA用T4多聚核苷酸激酶退火形成二聚體，用T4連接酶將SgRNA二聚體與酶切的lentiCRISPRv2質(zhì)粒連接，然后將連接產(chǎn)物體系轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取單個(gè)菌落搖菌，菌液提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序鑒定，測(cè)序引物為：hU6-F(5-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3)。將lentiCRISPRv2-SgRNA重組質(zhì)粒載體分別和慢病毒包裝骨架質(zhì)粒 pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞構(gòu)建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞上清，按照慢病毒純化試劑說明書純化慢病毒。

1.2.3 MLH1-/-混合克隆腫瘤細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定

用lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體分別感染Mc38細(xì)胞和4T1細(xì)胞，因載體中帶有Cas9分子量較大的蛋白，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)至第10天，Mc38細(xì)胞和4T1細(xì)胞分別在含有6 μg/mL和3 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至無大量細(xì)胞死亡后，更換含有半致死量嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western Blot檢測(cè)Cas9蛋白和MLH1蛋白的表達(dá)，篩選MLH1-/-混合克隆腫瘤細(xì)胞并保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮環(huán)境中。

1.2.4 MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞的篩選及鑒定

收集并制作MLH1-/-混合克隆腫瘤細(xì)胞單細(xì)胞懸液，經(jīng)96孔板流式分選制備含有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)體系，擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集單克隆細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白和基因組DNA，進(jìn)行Western Blot、PCR和測(cè)序鑒定，篩選MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞并保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮環(huán)境中。SgRNA1引物(5′-3′，700 bp)：CCCTGTGGTAGCAGCATGAA(上游)和CCAGCAGATCAAAGAGGCCA(下游)；SgRNA2引物(5′-3′，300 bp)：GCCACTAGG-CCTGTACTGTG(上游)和CGCCATGCCATAAAA-CCCAA(下游)。

1.2.5 MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞系微衛(wèi)星檢測(cè)

鼠源性微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)信息(表1)；收集連續(xù)培養(yǎng)約70 d的MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行熒光PCR-毛細(xì)管電泳鑒定細(xì)胞微衛(wèi)星狀態(tài)。

表1 小鼠腫瘤MSI檢測(cè)標(biāo)志物信息Table 1 Mice tumor MSI detection marker information

2 結(jié)果

2.1 lentiCRISPRv2-SgRNA質(zhì)粒載體的鑒定

構(gòu)建的MLH1基因敲除lentiCRISPRv2-SgRNA質(zhì)粒載體進(jìn)行一代測(cè)序獲得基因堿基序列，經(jīng)過比對(duì)，構(gòu)建的質(zhì)粒載體分別含有設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列SgRNA1和SgRNA2，證明本研究成功構(gòu)建了MLH1基因敲除lentiCRISPRv2-SgRNA1和lentiCRISPRv2-SgRNA2質(zhì)粒載體(圖2)。

A：SgRNA1序列；B：SgRNA2序列A: SgRNA1 sequence；B: SgRNA2 sequence圖2 質(zhì)粒載體鑒定結(jié)果Figure 2 Results of plasmid vector identification

2.2 MLH1-/-混合克隆腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

慢病毒敲除載體感染細(xì)胞后，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細(xì)胞，通過蛋白免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)Cas9蛋白和MLH1蛋白驗(yàn)證得到的MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細(xì)胞慢病毒感染情況和MLH1基因敲除的情況；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染組表達(dá)了Cas9蛋白(未感染慢病毒組不見Cas9蛋白表達(dá))，感染組的MLH1蛋白表達(dá)較未感染慢病毒組明顯下降，證明慢病毒已經(jīng)成功感染細(xì)胞，且成功構(gòu)建MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細(xì)胞系(圖3)。

A：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞Cas9蛋白的表達(dá)；B：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞Cas9蛋白的表達(dá)；C：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1的作用下的表達(dá)；D：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2的作用下的表達(dá)；E：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1的作用下的表達(dá)；F：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2的作用下的表達(dá)A: Expression of Cas9 protein in murine intestinal cancer MC38 cells；B: Expression of Cas9 protein in murine breast cancer 4T1 cells；C: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA1;D: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA2;E: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA1;F: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA2圖3 混合克隆腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)情況Figure 3 Protein expression of mixed clone tumor cells

2.3 MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過96孔板流式分選技術(shù)得到含有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，通過蛋白免疫印跡技術(shù)，挑選MLH1蛋白完全敲除的單克隆腫瘤細(xì)胞系；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染組部分單克隆腫瘤細(xì)胞系較未感染組MLH1蛋白完全不表達(dá)，從蛋白水平證明本研究成功構(gòu)建MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞系，包括MLH1基因敲除單克隆腸癌Mc38細(xì)胞系和MLH1基因敲除單克隆乳腺癌4T1細(xì)胞系(圖4)。

A：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1的作用下的表達(dá)；B：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2的作用下的表達(dá)；C：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1的作用下的表達(dá)；D：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2的作用下的表達(dá)A: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA1;B: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA2;C: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA1;D: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA2圖4 單克隆腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)情況Figure 4 Protein expression in monoclonal tumor cells

2.4 MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞MLH1基因敲除情況

提取MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的大小和進(jìn)行一代測(cè)序檢測(cè)基因組DNA片段的堿基序列；結(jié)果顯示，瓊脂糖凝膠上DNA電泳條帶大小分別為700 bp和300 bp左右，與設(shè)計(jì)的引物PCR片段大小一致，靶點(diǎn)SgRNA1前后引物在野生型MLH1基因組PCR片段大小為700 bp，靶點(diǎn)SgRNA2前后引物在野生型MLH1基因組PCR片段大小為300 bp；其中，26#單克隆細(xì)胞出現(xiàn)PCR引物的非特異性結(jié)合條帶(圖5D)。分析基因組DNA片段一代測(cè)序結(jié)果的峰圖，一致為單峰的峰圖結(jié)果和瓊脂糖凝膠上單一的DNA電泳條帶的結(jié)果，表明Cas9蛋白酶作用于兩條同源染色體同一位置，并且機(jī)體以同樣的堿基修復(fù)Cas9蛋白酶的剪切缺口，得到了在兩條同源染色體基因編輯位點(diǎn)上堿基序列一致的MLH1基因敲除的單克隆腫瘤細(xì)胞系。通過比對(duì)一代測(cè)序結(jié)果的堿基序列和MLH1基因野生型堿基序列，可以知道MLH1基因靶向SgRNA序列具體的基因編輯位點(diǎn)(圖6、7)和基因編輯堿基序列的改變；因?yàn)樵贑as9蛋白酶切割DNA雙鏈斷裂后由非同源末端連接途徑(NHEJ)進(jìn)行修復(fù)，所以得到基因編輯堿基序列不一致性的多個(gè)單克隆基因敲除細(xì)胞系。以上結(jié)果表明本研究構(gòu)建的MLH1基因敲除的單克隆腫瘤細(xì)胞系在基因水平得到了驗(yàn)證。(圖5-7，表2)

表2 小鼠腸癌細(xì)胞Mc38和乳腺癌細(xì)胞4T1突變位點(diǎn)序列信息Table 2 Sequence information of mutant sites of mouse colorectal cancer cell MC38 and breast cancer cell 4T1

A：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段；B：鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段；C：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段；D：鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段A: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA1 in murine colorectal cancer MC38 cells；B: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA2 in murine colorectal cancer MC38 cells；C: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA1 in murine breast cancer 4T1 cells；D: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA2 in murine breast cancer 4T1 cells圖5 單克隆腫瘤細(xì)胞MLH1基因組DNA片段Figure 5 The MLH1 genomic DNA fragment of monoclonal tumor cells

A：鼠源性腸癌Mc38-56#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；B：鼠源性腸癌Mc38-61#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；C：鼠源性腸癌Mc38-5#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；D：鼠源性腸癌Mc38-20#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；E：鼠源性腸癌Mc38-33#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；(▼為DNA片段堿基缺失位點(diǎn))圖6 單克隆腫瘤細(xì)胞Mc38-MLH1基因組DNA片段堿基缺失位點(diǎn)Figure 6 Base deletion sites of Mc38-MLH1 genomic DNA fragments in monoclonal tumor cells

A：鼠源性乳腺癌4T1-8#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；B：鼠源性乳腺癌4T1-50#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；C：鼠源性乳腺癌4T1-1#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；D：鼠源性乳腺癌4T1-26#單克隆細(xì)胞MLH1基因在靶點(diǎn)SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點(diǎn)；(▼為DNA片段堿基缺失位點(diǎn))圖7 單克隆腫瘤細(xì)胞4T1-MLH1基因組DNA片段堿基缺失位點(diǎn)Figure 7 Base deletion sites of 4T1-MLH1 genomic DNA fragments in monoclonal tumor cells

2.5 MLH1-/-單克隆腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星分析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，野生型鼠源性腸癌Mc38細(xì)胞系[11]和野生型鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞系[17]均為微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系，因此，本研究選取Mc38細(xì)胞系和4T1細(xì)胞系作為研究對(duì)象。人類基因組序列和小鼠基因組序列不完全一致，小鼠有著自己獨(dú)立的微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)，均為單堿基簡(jiǎn)單重復(fù)序列；根據(jù)小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成熒光引物，并上機(jī)檢測(cè)樣品微衛(wèi)星狀態(tài)；根據(jù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定判斷準(zhǔn)則，檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，有大于等于2個(gè)位點(diǎn)片段大小發(fā)生改變，則判斷該樣品微衛(wèi)星狀態(tài)為不穩(wěn)定；當(dāng)位點(diǎn)片段大小改變?cè)趦蓷l同源染色體上一致時(shí)，相比于對(duì)照組的微衛(wèi)星穩(wěn)定樣品的微衛(wèi)星檢測(cè)峰圖，實(shí)驗(yàn)組的微衛(wèi)星檢測(cè)峰圖僅會(huì)出現(xiàn)位置的偏移，主要體現(xiàn)為微衛(wèi)星檢測(cè)峰圖主峰位置的偏移；當(dāng)位點(diǎn)片段大小改變?cè)趦蓷l同源染色體上不一致時(shí)，相比于對(duì)照組的微衛(wèi)星穩(wěn)定樣品的微衛(wèi)星檢測(cè)峰圖，實(shí)驗(yàn)組的微衛(wèi)星檢測(cè)峰圖不僅會(huì)出現(xiàn)位置的偏移，還會(huì)出現(xiàn)峰圖數(shù)量的變化，即同源染色體等位基因雜合子的情況[18-21]。數(shù)據(jù)顯示，MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞Mc38-56#、4T1-26# 5個(gè)微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)峰值較野生型腸癌細(xì)胞的均發(fā)生了位置的偏移(表3、4)。

表3 野生型腸癌細(xì)胞與MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞Mc38-56#微衛(wèi)星比對(duì)Table 3 Comparison of microsatellite between wild-type colorectal cancer cells and MLH1 knockout monoclonal tumor cells MC38-56 #

表4 野生型乳腺癌細(xì)胞和MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞4T1-26#微衛(wèi)星比對(duì)Table 4 Comparison of microsatellite between wild-type breast cancer cells and MLH1 knockout monoclonal tumor cells 4T1-26#

3 討論

為了解決科學(xué)研究單一性的問題，本研究在MLH1基因序列上設(shè)計(jì)了2條SgRNA，其中SgRNA1序列特異性靶向MLH1基因的第四號(hào)外顯子，SgRNA2序列特異性靶向MLH1基因的第五號(hào)外顯子末端部分堿基序列及其后面部分內(nèi)顯子堿基序列；SgRNA的設(shè)計(jì)和選擇是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)特異性靶向編輯基因特定位點(diǎn)序列的導(dǎo)航系統(tǒng)，同時(shí)也為后期驗(yàn)證基因編輯變化提供了可循的依據(jù)。利用SgRNA分別構(gòu)建重組質(zhì)粒載體lentiCRISPRv2-SgRNA后，與慢病毒包裝骨架質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞構(gòu)建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體；實(shí)驗(yàn)室前期將重組質(zhì)粒載體lentiCRISPRv2-SgRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入腸癌細(xì)胞Mc38和乳腺癌細(xì)胞4T1，多次均未獲成功，利用慢病毒系統(tǒng)感染細(xì)胞，很好地解決了外源大分子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低下這個(gè)技術(shù)難題，同時(shí)慢病毒系統(tǒng)不僅提高了感染效率也提高了敲除效率。利用質(zhì)粒載體lentiCRISPRv2自帶的嘌呤霉素抗性和流式分選系統(tǒng)篩選陽性單克隆細(xì)胞。PCR及DNA測(cè)序結(jié)果表明陽性細(xì)胞株第四號(hào)外顯子/第五號(hào)外顯子成功敲除，Western Blot 結(jié)果證明陽性細(xì)胞株中MLH1蛋白表達(dá)完全缺失。至此，本研究共獲取9株MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞， 其中腸癌Mc38細(xì)胞5株(敲除第四號(hào)外顯子的2株，敲除第五號(hào)外顯子的3株)，乳腺癌4T1細(xì)胞4株(敲除第四號(hào)外顯子的2株，敲除第五號(hào)外顯子的2株)。

微衛(wèi)星是廣泛分布于基因組中單個(gè)、兩個(gè)、3個(gè)甚至更多個(gè)的串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的產(chǎn)生是由于DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)缺陷導(dǎo)致的微衛(wèi)星序列丟失或增加，它與MMR基因的缺失表達(dá)相關(guān)。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)由一系列酶組成，包括：MLH和MSH兩大家族，主要的家族成員分別有MLH家族的MLH1、MLH3、PMS1、PMS2和MSH家族的MSH2、MSH3、MSH6，這些酶檢測(cè)S期DNA復(fù)制錯(cuò)誤并修正DNA復(fù)制錯(cuò)誤，保證了DNA復(fù)制的保真性；MMR蛋白以異二聚體結(jié)構(gòu)維持蛋白穩(wěn)定性，常見的異二聚體組合主要有：MSH2-MSH6、MSH2-MSH3、MLH1-PMS2、MLH1-PMS1、MLH1-MLH3，MSH2異二聚體組合和MLH1異二聚體組合聯(lián)合發(fā)揮修復(fù)DNA復(fù)制錯(cuò)誤的功能，從異二聚體組合可以看出，MSH2和MLH1蛋白的正常表達(dá)，絕對(duì)的影響了機(jī)體錯(cuò)配修復(fù)功能的執(zhí)行，一旦缺失MLH1或者M(jìn)SH2，細(xì)胞DNA復(fù)制出現(xiàn)的錯(cuò)誤將無法修正。錯(cuò)配修復(fù)蛋白的缺失導(dǎo)致了錯(cuò)配修復(fù)功能無法執(zhí)行DNA復(fù)制出現(xiàn)的堿基配對(duì)錯(cuò)誤，這種錯(cuò)誤隨著DNA復(fù)制合成新的DNA子鏈而不斷地發(fā)生并保存在新合成的子鏈中[6-8]。對(duì)于錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失的腫瘤，需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)熒光PCR-毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定微衛(wèi)星位點(diǎn)序列的情況，明確腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)。人類微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)中，分別擴(kuò)增5個(gè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物和2個(gè)五核苷酸重復(fù)標(biāo)志物，其中5個(gè)單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物分別為 NR-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、MONO-27，這些標(biāo)志物均為準(zhǔn)單態(tài)性，即群體中幾乎所有個(gè)體該位點(diǎn)為同一等位基因純合狀態(tài)，2個(gè)五核苷酸重復(fù)標(biāo)志物為Penta D和Penta E，具有較高的多態(tài)性和較低的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，用于判斷腫瘤組織和正常組織是否來源于同一個(gè)患者。

本研究構(gòu)建的9株MLH1基因敲除單克隆腫瘤細(xì)胞分別為鼠源性腸癌細(xì)胞和鼠源性乳腺癌細(xì)胞，人類基因組序列和小鼠基因組序列不完全相同，因此，人類基因組微衛(wèi)星檢測(cè)的位點(diǎn)不能用于小鼠微衛(wèi)星檢測(cè)。小鼠有著自己獨(dú)立的微衛(wèi)星檢測(cè)位點(diǎn)，均為單核苷酸重復(fù)標(biāo)志物，分別為mBat64(A64)、AC096777(T27)、AA003063(A23)、U12235(A24)、L24372(A27)。本研究對(duì)獲取的9株單克隆腫瘤細(xì)胞在體外進(jìn)行為期70 d的連續(xù)培養(yǎng)后，選取MLH1基因敲除腸癌Mc38細(xì)胞5#、33#、56#、61#單克隆和乳腺癌4T1細(xì)胞26#單克隆進(jìn)行熒光PCR-毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞微衛(wèi)星狀態(tài)，陽性克隆微衛(wèi)星檢測(cè)結(jié)果分別與Mc38-WT細(xì)胞和4T1-WT細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，顯示本研究成功構(gòu)建MLH1基因敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定鼠源性腸癌細(xì)胞Mc38和鼠源性乳腺癌細(xì)胞4T1。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤，由于錯(cuò)配修復(fù)功能缺失，導(dǎo)致了基因組DNA序列的突變積累，形成了突變負(fù)荷的物質(zhì)基礎(chǔ)[9]；同時(shí)，這種基因組DNA序列上的突變積累轉(zhuǎn)錄后翻譯成更多的新蛋白，形成了更多的腫瘤新抗原，為抗腫瘤免疫治療提供了理論支持[22]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤由于缺失基因組錯(cuò)配修復(fù)功能，這種微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤獨(dú)特的特征是否會(huì)影響腫瘤內(nèi)一些重要信號(hào)通路分子相關(guān)基因和一些重要免疫分子相關(guān)基因DNA復(fù)制的保真性及其免疫激活的機(jī)制尚未可知。通過敲除細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)蛋白中的MLH1蛋白，構(gòu)建微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系，再移植到動(dòng)物模型，模擬再現(xiàn)人類微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的情況，為探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的免疫浸潤(rùn)模式和對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的抗腫瘤免疫治療進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究表明，僅有一小部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者在免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的治療方案中受益[16]，現(xiàn)有的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑抗腫瘤免疫治療方案更多關(guān)注的是T細(xì)胞在抗腫瘤免疫治療中的作用[23-29]，對(duì)于抗原提呈細(xì)胞[30-31]、自然殺傷細(xì)胞[32-33]和腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞[34-35]等其他免疫細(xì)胞抗腫瘤免疫治療中的重要作用也逐漸被揭示。同時(shí)，現(xiàn)有的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑抗腫瘤免疫治療方案更多的是批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性腫瘤患者，這一類腫瘤患者，腫瘤已經(jīng)通過血液途徑和(或)淋巴途徑轉(zhuǎn)移到了其他的臟器，對(duì)于全身免疫的激活有著非常重要的作用，那么，對(duì)于尚未形成轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，反應(yīng)更多的是局部免疫的激活，是通過自身腫瘤抗原的高表達(dá)和分泌的淋巴因子，對(duì)免疫激活進(jìn)行調(diào)控；研究表明，腫瘤外泌體上的PD-L1表達(dá)有著免疫抑制的作用，同時(shí)，也有著更好的免疫檢查點(diǎn)阻斷劑治療的臨床效益[36-37]。對(duì)于尚未轉(zhuǎn)移的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者，探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤外泌體在抗腫瘤免疫治療的機(jī)制有著非常重要的意義。

本研究構(gòu)建的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞系，為探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤包括T細(xì)胞在內(nèi)的免疫浸潤(rùn)模式、有顯著差異的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在抗腫瘤免疫治療的作用、微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤外泌體抗腫瘤免疫激活的機(jī)制、微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤轉(zhuǎn)移瘤抗腫瘤免疫激活的機(jī)制提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奈镔|(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)，本研究構(gòu)建的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞，錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1蛋白表達(dá)缺失，可以進(jìn)一步分析MLH1蛋白敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的免疫相關(guān)分子的變化，如PD-L1受體和MHC受體的表達(dá)水平變化，為研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤免疫激活的作用機(jī)制提供了細(xì)胞模型基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)聲明

劉名安：實(shí)驗(yàn)操作、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；李輝嚴(yán)：提供載體；柳玉紅：申請(qǐng)課題，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，修改論文；李建明：提出研究思路和框架，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。