紀佳月，韋柳晴，Zacharia Ackbarkhan，曾 靜

0引言

角膜病是我國第二大致盲眼病，也是除白內障之外唯一可通過手術治療提高視力而脫離盲狀態(tài)的眼病[1]，角膜移植手術是角膜病最重要的治療手段，然而角膜供體來源匱乏，使得角膜移植手術開展受到限制。因此，尋找合適的角膜移植材料成為治療角膜病的關鍵。全飛秒激光小切口微透鏡摘除術(small incision lentic extraction，SMILE)來源的角膜基質透鏡，透明度好，且完整保留了角膜基質原有的膠原纖維排列順序，是一種理想的角膜替代物。但單層角膜基質透鏡較薄，中央厚度僅約60～150μm，周邊更薄，無法應用于治療較大較深角膜潰瘍，而使用多層角膜基質透鏡進行角膜移植雖然可行，但縫合時容易發(fā)生相對滑動，增加手術難度，因此考慮使用生物粘合劑粘貼多層角膜基質透鏡來彌補以上不足。纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)來源于人的血漿，由纖維蛋白原及凝血酶兩部分組成，其工作原理是通過模擬血液凝固過程的最后一步，起到止血及組織粘合的作用，具有良好的生物降解性[2]。近年來，F(xiàn)S被廣泛應用于眼科手術中，包括眼科手術縫線的替代、翼狀胬肉手術中進行自體結膜瓣的固定[3-6]，以及人工晶狀體鞏膜固定術、黃斑脫離相關視盤凹陷手術和視網(wǎng)膜手術[7-11]等。因此考慮使用FS作為生物粘合劑粘貼雙層角膜基質透鏡作為角膜移植材料，但該種角膜移植材料生物相容性未知，可能會有增加排斥反應的風險，故需要檢測其生物相容性。本課題組此前對FS的體外生物相容性進行實驗研究，使用FS浸提液與角膜成纖維細胞共培養(yǎng)，從形態(tài)學、細胞生長及凋亡3個角度評估FS與角膜成纖維細胞的生物相容性，研究結果顯示，F(xiàn)S體外生物相容性良好，可應用于粘貼雙層角膜基質透鏡[12]。因此，本研究應用FS粘貼的雙層角膜基質透鏡作為植片，對兔行板層角膜移植，通過觀察兔板層角膜移植術后角膜恢復情況并進行組織病理學檢測，評估該種角膜移植片的體內生物相容性，進而探討使用其行板層角膜移植的可行性，為進一步臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康清潔級新西蘭白兔15只，雌雄不限，體質量約2.0～2.5kg，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，本研究已通過廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會審查。

1.1.2角膜基質透鏡組織角膜基質透鏡為廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科SMILE手術患者捐獻，捐獻者年齡18～27歲，無供體捐獻禁忌疾病。角膜透鏡厚度80～150μm，術中取出后展平貼于1.5mL滅菌離心管壁，-20℃冰箱凍存待用。

1.1.3主要試劑與設備顯微手術器械(蘇州六六視覺有限公司)；手術顯微鏡(德國Zeiss公司)；手持裂隙燈(蘇州六六視覺有限公司)；外用凍干人纖維蛋白粘合劑(上海萊士血制品有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組本實驗采用自身對照，以兔右眼為實驗眼，左眼為對照眼。實驗眼以FS粘貼雙層角膜基質透鏡為移植材料，行兔板層角膜移植術；對照眼不采取任何干預措施。

1.2.2纖維蛋白粘合劑的配制按照產(chǎn)品說明，將裝有纖維蛋白原粉末及滅菌注射用水的玻璃瓶置于37℃水浴預熱后，使用注射器吸取2mL滅菌注射用水注入高濃度纖維蛋白原瓶后繼續(xù)水浴加熱至粉末完全溶解；更換注射器，吸取2mL濃度為40mmol/L CaCl2溶液注入裝有凝血酶凍干粉的玻璃瓶中，配制濃度為500IU/mL的凝血酶溶液。

1.2.3角膜移植片的制備將兩片角膜基質透鏡從離心管中取出后置于10mL生理鹽水中室溫情況下復溫復水5min，復水結束后使用4.25mm環(huán)鉆于角膜基質透鏡中央鉆切，留取透鏡中央部分，使用FS粘貼雙片后置于冰盒待用。

1.2.4兔板層角膜移植術手術由同一術者在相同實驗環(huán)境下進行。術前3d，實驗眼滴左氧氟沙星滴眼液預防感染；術前使用體積分數(shù)為1%的戊巴比妥鈉按40mg/kg耳緣靜脈注射進行全身麻醉，麻醉滿意后將兔用無菌手術鋪單包裹置于手術臺上，滴用丙美卡因滴眼液2次行局部表面麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾、開瞼器開瞼。使用直徑4.0mm的角膜環(huán)鉆于兔角膜中央垂直鉆切植床，使用寶石刀進行板層剖切，深度約250～300μm，將植床邊緣及底部修至規(guī)整。將步驟1.2.3制備好的角膜植片覆蓋至植床表面，使用10-0尼龍線間斷縫合6針固定，線結隱蔽(圖1)。手術結束后，結膜下注射地塞米松，實驗眼涂小牛血去蛋白提取物眼用凝膠及妥布霉素地塞米松眼膏。術后單籠飼養(yǎng)，左氧氟沙星滴眼液、小牛血去蛋白提取物眼用凝膠滴術眼，每日3次；妥布霉素地塞米松眼膏涂眼，每日1次；術后2wk改用妥布霉素地塞米松滴眼液滴眼，每日3次。

圖1 兔板層角膜移植過程示意圖 A：FS粘貼雙層角膜基質透鏡，制備角膜移植片；B：制備板層角膜移植植床；C：間斷縫合6針固定植片。

1.2.5術后觀察指標

1.2.5.1裂隙燈觀察及生物相容性評分術后7、14、28d使用裂隙燈觀察雙眼角膜透明度、角膜水腫程度、新生血管生長情況、角膜上皮生長情況及排斥反應發(fā)生情況并行眼前節(jié)照相記錄；參照文獻[13]的評分方式對前3項觀察項目進行評分，評分標準見表1，并計算排斥指數(shù)(rejection index，RI)，RI=植片透明度評分+植片水腫程度評分+新生血管生長情況評分，若角膜移植術后28d內RI<6分視為生物相容性良好[14]。

表1 生物相容性評分標準

1.2.5.2組織病理學檢測角膜移植術后7、14、28d使用戊巴比妥鈉行過量麻醉法各處死5只兔，取兔雙眼角膜固定、包埋、制作石蠟切片、HE染色，對全層角膜恢復情況進行形態(tài)學觀察。觀察內容包括角膜上皮覆蓋情況、角膜植片內膠原纖維排列情況、炎性細胞浸潤情況、雙片透鏡間FS吸收情況、植片-植床的融合情況等。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位間距)[M(P25，P75)]進行統(tǒng)計描述，采用廣義估計方程進行統(tǒng)計分析。P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1裂隙燈觀察角膜情況移植術后7d，實驗眼角膜輕度水腫，移植區(qū)角膜欠透明，有少許新生血管生長至角膜緣，但未達植片，移植區(qū)角膜上皮尚未覆蓋移植片，移植區(qū)角膜熒光素染色著色；移植術后14d，實驗眼角膜水腫程度減輕，移植區(qū)角膜透明度提高，有少許新生血管生長至角膜緣未達植片，移植區(qū)角膜上皮基本覆蓋移植片，熒光素染色除縫線處外無著色；移植術后28d，實驗眼新生血管生長至角膜緣后未加重，角膜透明度較好，角膜上皮生長情況良好，無上皮及內皮排斥線等排斥反應，熒光素染色少許點狀著色。對照眼全程維持角膜透明，角膜上皮光滑(圖2)。

圖2 裂隙燈下兔眼前節(jié)照相 實驗眼角膜移植術后7d，結膜輕度充血，角膜植片欠透明，角膜植片中度水腫，角膜移植區(qū)上皮缺損，熒光素染色著色，有少許新生血管生長至角膜緣，但未達角膜移植片；實驗眼角膜移植術后14d，結膜充血消退，角膜植片較前透明，角膜植片水腫減輕，角膜移植區(qū)上皮細胞基本覆蓋移植材料，熒光素染色無著色，有少許新生血管生長，較前加重，新生血管生長至角膜緣，但未達角膜移植片；實驗眼角膜移植術后28d，角膜植片基本恢復透明，角膜植片幾乎無水腫，角膜上皮基本覆蓋植片，新生血管未見加重。

2.2生物相容性評分生物相容性評分結果顯示，使用FS粘貼的雙層角膜基質透鏡行板層角膜移植術后，實驗眼角膜透明度逐漸恢復，角膜水腫程度逐漸減輕，新生血管生長至角膜緣后未加重，至角膜移植術后28d，RI<6分，角膜植片的生物相容性較好；對照眼全程維持角膜透明。角膜移植術后7、14d，實驗眼和對照眼角膜透明度、水腫程度、新生血管生長情況評分差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；角膜移植術后28d，實驗眼和對照眼角膜透明度、水腫程度及新生血管生長情況評分差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.01)，見表2。

表2 雙眼角膜移植術后生物相容性評分比較 [M(P25，P75)，分]

2.3組織病理學檢測結果實驗眼角膜移植術后7d，角膜上皮尚未覆蓋植片，角膜膠原纖維排列紊亂，植片內有少許中性粒細胞浸潤，雙片透鏡間分界明顯，層間FS尚未吸收，植片與受體角膜貼合良好(圖3A)；角膜移植術后14d，可見有1～2層扁平狀角膜鱗狀上皮細胞覆蓋植片，角膜膠原纖維排列紊亂，植片內有少許中性粒細胞浸潤，雙層透鏡大部分融合，層間FS大部分吸收，植片與受體角膜貼合(圖3B)；角膜移植術后28d，植片表面有4～5層角膜上皮細胞覆蓋，其中表面1～3層為扁平狀上皮細胞，基底層細胞為柱狀上皮細胞，角膜膠原排列整齊、規(guī)則，植片內未見中性粒細胞浸潤，雙片透鏡間分界消失，層間FS完全吸收，植片與受體角膜融合，未見明顯分界(圖3C)。對照眼角膜形態(tài)正常，角膜表面可見多層角膜上皮細胞覆蓋，角膜膠原纖維排列整齊，無炎性細胞浸潤(圖3D)。

圖3 兔角膜切片HE染色 A：實驗眼角膜移植術后7d全層角膜切片，角膜上皮未覆蓋植片，角膜膠原纖維排列紊亂，植片內有少許中性粒細胞浸潤，層間FS尚未吸收，植片與植床貼合良好；B：實驗眼角膜移植術后14d全層角膜切片，單層角膜上皮覆蓋植片，角膜膠原纖維排列紊亂，植片內有少許中性粒細胞浸潤，層間FS大部分吸收，植片與植床貼合；C：實驗眼角膜移植術后28d全層角膜切片，植片表面有2～3層角膜上皮細胞覆蓋，角膜膠原排列整齊、規(guī)則，植片內未見中性粒細胞浸潤，F(xiàn)S完全吸收，植片與植床融合；D：對照眼全層角膜切片。白色箭頭示角膜基質透鏡；白色三角示未被吸收的FS。

3討論

角膜移植是治療角膜盲的關鍵手段，但現(xiàn)有角膜供體無法滿足臨床需求，而現(xiàn)有角膜供體替代物包括脫細胞豬角膜、羊膜及人工角膜等仍有許多缺點：(1)脫細胞豬角膜是異種角膜組織，存在異種免疫排斥反應及傳播動物源性疾病的風險；(2)羊膜組織的承壓能力較弱，對于潰瘍已接近后彈力層或已出現(xiàn)后彈力層膨出的患者治療無效；(3)人工角膜材料的研發(fā)技術尚未成熟，可應用的適應證較少，術后出現(xiàn)的并發(fā)癥多。因此尋找合適的角膜替代物具有重要的臨床意義。本研究以FS粘貼雙層角膜基質透鏡構建新型角膜移植材料，并應用于兔角膜進行板層角膜移植，評估其在體內的安全性、生物相容性及角膜移植術后的恢復情況。

本研究結果顯示，使用該種移植片進行板層角膜移植術后，角膜移植片可以在眼內穩(wěn)定存在，可以完全貼合于宿主原有角膜組織，即移植片對生物體產(chǎn)生的反應較小，具有良好的生物穩(wěn)定性；實驗眼角膜在術后14d后逐漸恢復透明，水腫程度逐漸減輕，新生血管生長至角膜緣后未加重，術眼未出現(xiàn)眼內感染即上皮、內皮排斥線等排斥反應；到實驗期末，實驗眼角膜透明度、水腫程度恢復情況與正常眼角膜差別不大，即該種角膜移植片在實驗觀察期間可被機體所耐受。組織病理檢測結果顯示，實驗眼角膜于術后14d即可形成1～2層扁平狀鱗狀角膜上皮細胞覆蓋角膜移植片，此后植片表面的上皮細胞繼續(xù)增殖，形成正常角膜上皮的復層結構。此外，角膜移植術后14d，實驗眼可見雙層透鏡間FS大部分被機體吸收，術后28d，雙層透鏡間FS完全被吸收，即FS可在角膜移植術后14～28d被機體自行吸收。由此可見，本研究構建的角膜移植片具有良好的生物相容性，免疫原性低，術后恢復情況良好。但作為可替代角膜供體的角膜移植材料，除具有良好的生物相容性外，還必須具有足夠的生物力學強度，并可以支持細胞在材料表面粘附、增殖和遷移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，角膜移植術后28d，實驗眼角膜未出現(xiàn)凸出等形態(tài)改變，說明構建的角膜植片可承受一定程度的眼內壓，具有一定的生物力學強度。角膜移植術后7d，實驗眼尚無角膜上皮細胞覆蓋角膜移植片；術后14d，已形成1～2層扁平狀角膜鱗狀上皮細胞覆蓋植片；術后28d，植片表面有4～5層角膜上皮細胞覆蓋，上皮細胞結構與正常角膜上皮相似，由此可見，角膜上皮細胞可以在此種角膜移植片表面增殖、生長及遷移良好。上述結果表明，本研究所構建的角膜移植片應用于體內的安全性良好，具有低免疫原性，生物相容性良好，所使用的FS可被機體完全吸收，具有足夠的生物力學強度，并可以支持細胞在材料表面粘附、增殖和遷移，適用于角膜損傷的修復，理論上可以作為角膜供體的替代物應用于小直徑角膜潰瘍穿孔及角膜皮樣瘤的治療。

既往本課題組對FS粘貼雙層角膜基質透鏡構建的角膜移植材料的保存條件進行了研究，將構建的角膜移植材料分別置于無水甘油、玻璃酸鈉、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及濕房環(huán)境中保存，觀察保存后角膜移植材料的狀態(tài)，結果顯示置于甘油和濕房環(huán)境內的角膜移植材料穩(wěn)定性較好；隨后對使用甘油保存的溫度條件進行研究，發(fā)現(xiàn)置于-20℃環(huán)境中的角膜移植材料狀態(tài)較好，無變黃及卷曲[16]。而本研究中采用-20℃無介質冷凍法對取出的角膜基質透鏡進行保存，在使用時對單層角膜基質透鏡進行復溫復水后再進行粘貼，既降低了雙層角膜基質透鏡在復溫復水的環(huán)節(jié)發(fā)生開裂的風險，又較易實現(xiàn)、操作簡單，更易于臨床應用；而且角膜基質透鏡僅由膠原纖維及少量角膜基質細胞構成，無上皮細胞及內皮細胞成分，在無保存介質的條件下進行凍存對角膜基質透鏡成分活性影響不大。

然而，本研究仍存在一些問題需要進一步研究：(1)本研究僅對使用角膜移植材料進行板層角膜移植后1mo內角膜的恢復情況進行了觀察，觀察時間較短，僅能排除該種角膜移植材料的短期排斥風險，而無法排除該種角膜移植材料的長期排斥風險。既往研究發(fā)現(xiàn)，使用單純雙層角膜基質透鏡為角膜潰瘍患者進行治療性板層角膜移植手術，術后角膜基質透鏡會發(fā)生溶解現(xiàn)象，但本研究中尚未觀察到角膜基質透鏡的溶解現(xiàn)象，考慮角膜基質透鏡的溶解可能是由于角膜潰瘍疾病過程中釋放的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，尤其是MMP-1、MMP-9，導致角膜基質膠原纖維溶解。(2)本研究采用空白對照眼與該種角膜移植材料行板層角膜移植的實驗眼進行對照，僅檢測了該種角膜移植材料對宿主角膜組織的反應及宿主角膜組織對角膜移植材料的反應，即角膜移植材料的生物相容性，未與使用其他角膜移植材料進行板層角膜移植手術后的情況進行對比。(3)本研究中構建的角膜移植材料成分僅為角膜基質，對于伴有雙眼角膜緣干細胞缺乏的角膜病患者，自身角膜緣干細胞無法滿足移植或體外擴增的需求，即使使用雙層角膜基質透鏡進行角膜移植也未必成功。我們將在下一步的實驗研究中，對上述問題進行后續(xù)研究。