黃家祥，王中新，潘亞萍，徐元宏

大腸埃希菌是引起醫(yī)院和社區(qū)感染的主要病原體之一，通常作為人類和動(dòng)物腸道正常菌群存在，但是在某些情況下，可引起人類腸道感染，還可侵入腸外組織引起尿路感染、腹腔感染、膽道感染、肺部感染、血流感染、腦部感染和肌肉結(jié)締組織感染等[1]。近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiaColi，CREC)已屢見不鮮。為了更好了解CREC耐藥情況，預(yù)防耐藥菌株院內(nèi)傳播，該研究收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院近5年的大腸埃希菌，從中篩選出碳青酶烯耐藥的菌株，探討CREC產(chǎn)碳青霉烯酶的表型、產(chǎn)酶基因的構(gòu)成及其分子流行病學(xué)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年1月-2019年12月臨床標(biāo)本分離并-20 ℃保存的6 092株大腸埃希菌，選取對厄他培南、亞胺培南或美羅培南耐藥的菌株，轉(zhuǎn)種血瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇細(xì)菌，剔除重復(fù)分離株和死亡株，共71株CREC納入本次研究。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。

1.2 儀器與試劑Vitek-2 Compact微生物鑒定儀、MALDI-TOF-MS質(zhì)普儀、血瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基(法國Bio Merieux公司)，PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀(美國BIO-RAD公司)，高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，生物安全柜(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)，亞胺培南西司他丁鈉[默沙東(中國)有限公司]，瓊脂糖(德國Biofroxx公司)，硫酸鋅、酚紅(中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，Taq PCR Mix 預(yù)混液(2×，含紅染料)、引物、4S Red Plus核酸染料、TBE粉末、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 細(xì)菌鑒定與藥敏采用Vitek-2 Compact進(jìn)行細(xì)菌鑒定，MALDI-TOF-MS質(zhì)普儀進(jìn)行確認(rèn)。細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)采用Vitek-2 Compact配套藥敏卡AST-N334，紙片法進(jìn)行復(fù)核和補(bǔ)充。

1.4 耐碳青酶烯酶表型實(shí)驗(yàn)

1.4.1改良Hodge實(shí)驗(yàn) 用無菌生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊拇竽c埃希菌ATCC 25922菌懸液，將菌懸液用生理鹽水按1 ∶10稀釋后，無菌棉簽蘸取稀釋后的菌液，均勻涂布于MH瓊脂平板上，自然干燥5～10 min，平板中央貼美羅培南(10 μg)紙片，用一次性無菌1 μl接種環(huán)挑取適量過夜培養(yǎng)的待測菌落，沿美羅培南紙片邊緣，垂直方向畫待測菌線，菌線長20～25 mm，空氣環(huán)境中35 ℃培養(yǎng)18～24 h，結(jié)果判讀：待測菌線與抑菌圈交界處大腸埃希菌ATCC 25922呈增強(qiáng)生長，判為陽性結(jié)果；無增強(qiáng)生長，則為陰性結(jié)果。

1.4.2mCIM實(shí)驗(yàn) 用10 μl接種環(huán)刮取1環(huán)血瓊脂平板過夜培養(yǎng)的待測細(xì)菌加入含400 μl無菌水的EP管中，震蕩混勻，浸入美羅培南紙片(10 μg)，35 ℃溫育2 h。取出紙片，擠出多余菌液，貼于均勻涂布有0.5麥?zhǔn)蠞舛却竽c埃希菌ATCC 25922菌液的MH瓊脂上，35 ℃溫育18～24 h，測量抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：① 抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落生長，提示待測菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。② 抑菌圈直徑≥19 mm，提示待測菌株不產(chǎn)碳青霉烯酶。③ 抑菌圈直徑為16～18 mm或直徑為≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落生長，提示無法判斷是否存在碳青霉烯酶。

1.4.3Carba NP實(shí)驗(yàn) 取a、b兩個(gè)無菌EP管，均加入100 μl細(xì)菌蛋白提取液，用1 μl接種環(huán)取兩環(huán)血平板上培養(yǎng)過夜的待測菌單菌落分別加入a、b管中，渦旋震蕩5～10 s，再向a管中加入A液100 μl，向b管中加入B液100 μl，35 ℃孵育2 h，每0.5 h觀察記錄管中顏色變化。結(jié)果判讀：① a、b管均為紅色或橙紅色，提示未檢出碳青霉烯酶。② a管紅色或橙紅色，b管淺橙色、黃色或深黃色，提示檢出碳青霉烯酶。③ a管紅色或橙紅色，b管橙色，提示試驗(yàn)結(jié)果無效。④ a管橙色、黃色或深黃色，b管任何顏色，提示試驗(yàn)結(jié)果無效。

1.5 PCR擴(kuò)增耐藥基因參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)碳青霉烯酶基因引物，并由上海生工公司合成，引物序列見表1。采用煮沸法制備擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μl：Taq PCR Master Mix(2×，red dye)25 μl，10 μmol/L正反引物各2 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 20 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s、根據(jù)各引物退火溫度退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、39個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工公司進(jìn)行測序，使用NCBI網(wǎng)站的Blast程序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行比對，以確定基因型及其亞型。

表1 PCR引物序列

1.6 ERIC-PCRERIC-1引物序列為： 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC-2引物序列為：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，由上海生工公司合成，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察紀(jì)錄結(jié)果。結(jié)果判斷：將電泳圖譜條帶位置相同的菌株視為同一型別。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照CLSI 2018標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，使用WHONET 5.4軟件對細(xì)菌數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株基本資料5年間CREC的檢出率分別為1.00%(12/1198)、1.12%(14/1247)、1.01%(13/1287)、1.22%(15/1230)、1.50%(17/1130)，71株CREC主要來自尿液29株，其次為痰液15株，分泌物10株，血液5株；穿刺液、創(chuàng)面、腹水、引流液各2株；膽汁、腦脊液、膿液和咽拭子均為1株。病區(qū)來源以ICU和燒傷科為主，分別為8株和7株，其次為泌尿外科、門診各5株；肝膽外科、感染科、急診內(nèi)科和康復(fù)科各4株；干部病房、神經(jīng)外科、血液科和腫瘤科各3株；風(fēng)濕科、呼吸科、神經(jīng)內(nèi)科、腎內(nèi)科、胃腸外科、消化科和心臟外科各2株；產(chǎn)科、新生兒科、內(nèi)分泌科和皮膚科各1株。

2.2 藥物敏感性結(jié)果71株CREC對常見抗菌藥物的耐藥率普遍居高，見表2。

表2 71株CREC對常見抗菌藥物的耐藥率

2.3 表型試驗(yàn)結(jié)果71株CREC中45株MHT陽性， 67株mCIM陽性，69株Carba NP陽性，陽性率分別為63.38%、94.37%、97.18%。部分陽性結(jié)果見圖1～3。

圖1 部分菌株MHT試驗(yàn)結(jié)果陽性對照：1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；21：編號(hào)21的CREC(MHT陽性)

圖2 部分菌株mCIM試驗(yàn)結(jié)果陽性對照：ATCC 1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：ATCC 1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；9、12：編號(hào)9、12的大腸埃希菌(mCIM陽性)

圖3 部分菌株Carba NP試驗(yàn)結(jié)果陽性對照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；陰性對照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；1～5：Carba NP試驗(yàn)陽性菌株；47：Carba NP試驗(yàn)陰性菌株

2.4 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果71株CREC共有43株檢出碳青酶烯酶基因，檢出率為60.56%，34株攜帶blaNDM中有7株為blaNDM-1，27株為blaNDM-5，9株攜帶blaKPC均為blaKPC-2。其余碳青酶烯酶基因blaBIC、blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaDIM、blaSIM、blaGES、blaOXA-48均未檢出。部分碳青酶烯酶基因電泳圖譜見圖4。

圖4 部分blaNDM陽性電泳圖譜M：DL2000 DNA Marker；1：陰性對照；2：陽性對照；3～11：blaNDM陽性菌株；12：blaNDM陰性菌株

2.5 ERIC-PCR結(jié)果71株CREC的ERIC-PCR電泳圖譜產(chǎn)生2～8條不同的條帶模式，范圍從100～2 000 bp，共分為19個(gè)型別，其中A型9株，B型8株，C型7株，D型6株，E型6株，F(xiàn)型5株，G型5株，H型4株，I型4株，J型4株，K型3株，L型2株，M型2株，N型、O型、P型、Q型、R型、S型各1株。部分菌株ERIC-PCR電泳圖譜見圖5。

圖5 部分菌株ERIC-PCR電泳圖譜M：DNA Marker；2、3、6、8、11、14：B型；1、4、9、10、13、15：C型；18：A型；16：D型；19：E型；17：G型；7：K型；5：M型；12：P型

3 討論

近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae, CRE)在世界范圍內(nèi)越來越普遍。中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)CHINET監(jiān)測結(jié)果[6]顯示大腸埃希菌對亞胺培南的耐藥率由2014年的0.9%上升到2019年的2.0%。另外CRE感染往往會(huì)引起較高的死亡率，Tamma et al[7]研究發(fā)現(xiàn)32%的CRE血液感染患者在14 d內(nèi)死亡，因此，防控CRE的產(chǎn)生和傳播意義重大。

5年間，本院CREC的檢出率基本維持在低位水平，平均為1.17%，且分離至不同年份不同科室，ICU和燒傷科來源的菌株數(shù)量略高于其他科室，可能與這兩個(gè)科室的患者病情常較重，大量抗生素的使用和進(jìn)行過侵襲性操作有關(guān)。本研究中，尿液標(biāo)本分離的CREC高于其他樣本類型，與Tian et al[8]研究結(jié)果一致，這對臨床醫(yī)師治療泌尿道感染提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，由于氨基糖苷類、喹諾酮類和碳青霉烯類藥物通常用于治療泌尿系統(tǒng)感染，而CREC對這幾類藥物往往表現(xiàn)出較高的耐藥性。

到目前為止，CLSI先后推薦了MHT、Carba NP和mCIM作為碳青霉烯酶的表型篩選實(shí)驗(yàn)。MHT操作簡單且成本低廉，對流行廣泛的KPC具有很好的檢測能力，但對新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(NDM)、粘質(zhì)沙雷菌型碳青霉烯酶(SME)和苯唑西林酶(OXA)的敏感性較低[9]。Carba NP通過測量細(xì)菌提取物對亞胺培南的體外水解情況來檢測碳青霉烯酶，Carba NP對大多數(shù)碳青霉烯酶具有較好的敏感性，然而，在檢測相對較弱的OXA型碳青霉烯酶時(shí)存在一定的局限[10]。mCIM是2017年CLSI推薦的一種用于篩選碳青霉烯酶表型的新型試驗(yàn)，有研究[11]表明mCIM篩選腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶具有較高的特異性和敏感性。本研究中，34株產(chǎn)NDM的菌株只有22株MHT陽性，說明MHT對NDM型碳青霉烯酶的檢測能力有限。71株CREC，mCIM陽性67株，陽性率94.4%，略低于閆玲 等[12]報(bào)道的陽性率100%。Carba NP陽性69株，僅有2株陰性，雖然Carba NP具有很好的檢測效能，但是所需試劑準(zhǔn)備繁瑣、保質(zhì)期較短，大規(guī)模流行病學(xué)篩查遠(yuǎn)比實(shí)驗(yàn)室小樣本檢測更能體現(xiàn)其優(yōu)勢。

產(chǎn)NDM細(xì)菌發(fā)現(xiàn)之初被稱為“超級細(xì)菌”，可見其耐藥情況嚴(yán)重，NDM能夠水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，大腸埃細(xì)菌和肺炎克雷伯菌是blaNDM的主要攜帶者。目前世界范圍內(nèi)均發(fā)現(xiàn)NDM陽性菌株，尤以印度次大陸、中東和巴爾干地區(qū)的流行率最高[13]。一項(xiàng)關(guān)于CRE在國內(nèi)流行情況的研究[14]顯示，25個(gè)省、直轄市中，除北京、上海和四川外，NDM是CREC最常見的碳青霉烯酶。本研究中，43株CREC檢出耐碳青霉烯基因，34株(34/43，79%)攜帶blaNDM，9株(9/34，21%)攜帶blaKPC-2，提示blaNDM是本院CREC主要攜帶的碳青霉烯酶基因，與全國絕大多數(shù)地區(qū)相一致。

ERIC-PCR是一種可靠、快速的基因分型方法，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的流行病學(xué)研究。本研究使用該技術(shù)對71株CREC之間的遺傳相關(guān)性進(jìn)行研究，CREC被分為A-S共19個(gè)型別，沒有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢型別，相同型別菌株所屬科室較為分散，且分離年份未見集中現(xiàn)象。說明本院流行的CREC基因多態(tài)性較高，以散發(fā)為主。