譚邦銀，于浩飛，謝建平，張素婷，王 晶，尹文耀，丁彩鳳，張榮平，郭 英，張?zhí)m春

目前，臨床多用西藥治療抑郁癥，存在副作用大等問題，中藥治療副作用則相對(duì)較小，因而從中藥中篩選抗抑郁的藥用資源，逐漸受到關(guān)注[1]?；ń窞槭|香科植物青花椒Zanthoxylumschinifolium或花椒Zanthoxylumbungeanum的干燥成熟果皮，其含有生物堿等化合物[2]?；ń犯刻崛∥锟赏ㄟ^調(diào)節(jié)海馬中的神經(jīng)炎癥和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為[3]，而粗提物中化學(xué)成分種類較多，雖有抗抑郁作用，也不利于直接作為藥物使用，更不利于從中分離高效的抗抑郁單體。本研究針對(duì)這一不足，鑒于臨床療效確切的抗抑郁藥多為生物堿，故按富集生物堿的方法制備兩受試物。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)[3]資料，以單次灌胃200 mg/kg受試物進(jìn)行治療，并進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，監(jiān)測(cè)血清與皮層中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、5-羥色胺(5-hydroxytryptophan, 5-HT)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)以及血清和腦中一氧化氮(nitric oxide, NO)的水平變化，初步評(píng)價(jià)兩受試物的抗抑郁作用，旨為從兩受試物中分離高效低毒的抗抑郁單體提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性ICR小鼠45只， 4～5周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)K2020-0004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的同意。

1.2 主要儀器與試劑多功能酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；高速組織勻漿儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)；含種子的干青、紅花椒果皮(市售)；鹽酸舍曲林片(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：H10980141)；橄欖油(益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司)；Mouse BDNF ELISA檢測(cè)試劑盒、Mouse 5-HT ELISA檢測(cè)試劑盒、Mouse GSH ELISA檢測(cè)試劑盒、Mouse NO ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 花椒提取物的制備分別取青花椒和紅花椒粉末，加3倍量甲醇，(76±2) ℃提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，得青花椒和紅花椒浸膏。取青花椒浸膏，加水稀釋，鹽酸調(diào)pH為2～3，抽濾，濾液加氨水調(diào)pH為9～10，加3倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓回收溶劑，冷凍干燥，即得青花椒提取物；另取紅花椒浸膏，加水稀釋，D101大孔樹脂吸附，依次用水、35%甲醇及甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，回收甲醇，加少量乙酸乙酯，除去脂溶性成分，減壓揮干溶劑，冷凍干燥，即得紅花椒提取物。

1.4 分組與造模將小鼠隨機(jī)分成5組，每組9只，分別為正常組、模型組、鹽酸舍曲林組(10 mg/kg)、紅花椒提取物組(200 mg/kg)與青花椒提取物組(200 mg/kg)；記錄小鼠體質(zhì)量W0(g)，模型組及給藥組用慢性束縛應(yīng)激的方式復(fù)制抑郁模型，具體方法為：將小鼠放入50 ml四周開有通氣孔的特制離心管中，用紗布與膠帶封住離心管口，連續(xù)8 d，每天11 h。

1.5 給藥與行為學(xué)測(cè)試整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程只給予一次藥物治療，具體方法為：造模結(jié)束1 d后，記錄小鼠體質(zhì)量W1(g)。稱取鹽酸舍曲林，加橄欖油配成1 mg/ml的混懸液；取青花椒和紅花椒提取物用橄欖油各配成20 mg/ml的混懸液，按0.1 ml/10 g灌胃給藥，正常組和模型組則同法給予橄欖油。給藥后第1天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將小鼠放入長(zhǎng)、寬均為50 cm，高為40 cm，底部為黑色的敞口木箱中央，記錄6 min內(nèi)小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)(central area times，CAT)、中央時(shí)間百分比(percentage of central time，PCT)和中央路程百分比(percentage of central distance，PCD)。每只小鼠測(cè)試結(jié)束后，用75%乙醇溶液擦拭箱底，除去上一只小鼠留下的排泄物及氣味，待酒精揮干后，再測(cè)試下一只小鼠。給藥后第2天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將小鼠放入裝有4.5 L水的5 L透明燒杯中，水溫(25±2) ℃，待小鼠自由游泳適應(yīng)2 min后，記錄6 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間百分比。每測(cè)完一只小鼠更換一次水。

1.6 ELISA法檢測(cè)BDNF、5-HT、GSH及NO的含量給藥后第3天，記錄小鼠體質(zhì)量W2(g)，用2%水合氯醛麻醉小鼠，心尖取血，全血4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得待測(cè)液；取血后，處死小鼠并迅速取出小鼠大腦，液氮冷凍20 min后移至-80 ℃冰箱保存。指標(biāo)測(cè)試前，取出小鼠大腦，冰上快速分離皮層，稱重，9 g樣品加2% PBS溶液1 ml，勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得BDNF、GSH及5-HT待測(cè)液；取去除大腦皮層的半腦，稱重，10 g樣品加1 ml的NO提取液，勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得NO待測(cè)液。按ELISA 試劑盒說明書測(cè)定上述待測(cè)液中BDNF、5-HT、GSH及NO的含量。

2 結(jié)果

2.1 花椒提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響與正常組相比，各組小鼠W0無明顯差異(FW0=0.80,P>0.05)，各組小鼠W1均降低，表明慢性束縛應(yīng)激可致小鼠體質(zhì)量降低(FW1=5.39,P<0.01)。與模型組相比，鹽酸舍曲林組與紅花椒提取物組小鼠W2均增加，提示紅花椒提取物能逆轉(zhuǎn)小鼠體質(zhì)量的降低(FW2=4.09,P<0.05)，作用效果與鹽酸舍曲林相當(dāng)，見表1。

表1 花椒提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 花椒提取物對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響與正常組相比，模型組PCT、PCD及CAT均降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，表明慢性束縛應(yīng)激可致小鼠焦慮樣行為；與模型組相比，紅花椒提取物組PCD和CAT均增加(FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01,P<0.05)；鹽酸舍曲林組和青花椒提取物組的PCT、PCD和CAT均增加(FPCT=3.60,FPCD=5.03,FCAT=4.25;P<0.01)；表明紅花椒、青花椒提取物均可改善小鼠焦慮樣行為，作用效果同鹽酸舍曲林。見表2。

表2 花椒提取物對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響

2.3 花椒提取物對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比的影響如圖1所示，與正常組相比，模型組不動(dòng)時(shí)間百分比增加(P<0.05)，表明慢性束縛應(yīng)激可致小鼠抑郁樣行為；與模型組相比，鹽酸舍曲林組、紅花椒提取物組及青花椒提取物組均能降低小鼠不動(dòng)時(shí)間百分比(F=3.599;P<0.05,P<0.05,P<0.01)，提示紅花椒提取物和青花椒提取物均能改善小鼠的抑郁樣行為，作用效果與鹽酸舍曲林相當(dāng)。

圖1 花椒提取物對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比的影響(n=9)A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05

2.4 花椒提取物對(duì)小鼠血清和皮層中BDNF的影響血清BDNF水平：與正常組相比，模型組、紅花椒提取物組和青花椒提取物組均降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組和青花椒提取物組均無明顯變化(F血清=5.467,P>0.05)，紅花椒提取物組較鹽酸舍曲林組有差異(P<0.05)，表明前者作用較后者弱，見圖2a；皮層BDNF水平：與正常組相比，模型組降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽酸舍曲林組和紅花椒提取物組均增加(F皮層=9.893,P<0.01)，提示紅花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠大腦皮層中的BDNF水平有關(guān)，作用效果與鹽酸舍曲林相當(dāng)，見圖2b。

圖2 花椒提取物對(duì)小鼠血清中和皮層中BDNF的影響(n=5)A：花椒提取物對(duì)小鼠血清中BDNF水平的影響；b：花椒提取物對(duì)小鼠皮層中BDNF水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01；與鹽酸舍曲林組比較：$P<0.05

2.5 花椒提取物對(duì)小鼠血清和皮層中5-HT的影響如圖3所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和皮層中5-HT水平均降低(P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組小鼠血清和皮層中5-HT水平均增加(F血清=3.121,F皮層=2.105;P<0.05)，表明紅花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠血清和皮層中的5-HT水平有關(guān)；青花椒提取物組小鼠皮層中5-HT的水平增加(F皮層=2.105,P<0.05)，血清中無明顯變化，提示青花椒提取物抗抑郁作用與改善小鼠皮層中5-HT水平有關(guān)，兩花椒提取物改善血清或皮層中5-HT水平的作用與鹽酸舍曲林相當(dāng)。

圖3 花椒提取物對(duì)小鼠血清中和皮層中5-HT的影響(n=5)A：花椒提取物對(duì)小鼠血清中5-HT水平的影響；b：花椒提取物對(duì)小鼠皮層中5-HT水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05；與正常組比較：#P<0.05

2.6 花椒提取物對(duì)小鼠血清和皮層中GSH的影響如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和皮層中GSH水平均降低(P<0.01,P<0.05)；與模型組相比，紅花椒提取物組小鼠血清和皮層中GSH水平均改善(F血清=12.271,F皮層=2.664;P<0.01)，表明紅花椒提取物抗抑郁作用與增加小鼠血清和皮層中GSH的水平密切相關(guān)；鹽酸舍曲林組和青花椒提取物組小鼠血清中GSH的水平均增加(F血清=12.271,P<0.01)，皮層中GSH的水平均無明顯變化，提示青花椒提取物的抗抑郁作用與改善血清中GSH水平有關(guān)。

圖4 花椒提取物對(duì)小鼠血清中和皮層中GSH的影響(n=5)A：花椒提取物對(duì)小鼠血清中GSH水平的影響；b：花椒提取物對(duì)小鼠皮層中GSH水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.7 花椒提取物對(duì)小鼠血清和腦中NO的影響

如圖5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清和腦中的NO的水平均增加(P<0.01)；與模型組相比，青花椒提取物組小鼠血清和腦中的NO的水平均降低(F血清=3.881,F腦=4.161,P<0.05)，表明青花椒提取物的抗抑郁作用與降低NO水平密切相關(guān)，且作用與鹽酸舍曲林相當(dāng)；紅花椒提取物組小鼠血清和腦中的NO水平只呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。

圖5 花椒提取物對(duì)小鼠血清中和腦中NO的影響(n=5)A：花椒提取物對(duì)小鼠血清中NO水平的影響；b：花椒提取物對(duì)小鼠腦中NO水平的影響；A：正常組；B：模型組；C：鹽酸舍曲林組；D：紅花椒提取物組；E：青花椒提取物組；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

抑郁癥的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類生命健康[4]，鹽酸舍曲林作為一線抗抑郁藥物，具有較好的療效，在臨床被廣泛應(yīng)用，有研究[5-6]表明其治療效果與文拉法辛相當(dāng)，治療總有效率達(dá)83.33%，但其也具有可累及神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等全身多個(gè)重要系統(tǒng)器官，且為遲發(fā)型的不良反應(yīng)。近年來，天然產(chǎn)物因其安全性高，從中篩選抗抑郁藥物逐漸受到重視，五乙酰梔子苷、姜黃素等正廣泛開展抗抑郁研究，結(jié)果表明兩者均具有較好的抗抑郁作用，其中五乙酰梔子苷可通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)軸，進(jìn)而改善慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激所致大鼠抑郁行為[7-8]?；ń肥且环N藥食同源的日常調(diào)味品，安全性高，有研究[3]表明其根部提取物具有較好的抗抑郁作用，具有深入研究的價(jià)值。

慢性束縛應(yīng)激是使小鼠長(zhǎng)時(shí)間束縛于密閉環(huán)境，最終感到逃脫無望而產(chǎn)生類似人類絕望、乏力等癥狀，廣泛用于復(fù)制小鼠抑郁模型。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)焦慮狀態(tài)，強(qiáng)迫游泳則廣泛用于評(píng)價(jià)抑郁狀態(tài)。本研究通過慢性束縛應(yīng)激復(fù)制抑郁模型，經(jīng)曠場(chǎng)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠焦慮和抑郁狀態(tài)，結(jié)果表明慢性束縛應(yīng)激可致小鼠體質(zhì)量降低，并產(chǎn)生典型的焦慮和抑郁樣行為；較模型組，紅花椒提取物可逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激所致小鼠的體質(zhì)量降低，且給藥組均能改善抑郁小鼠異常的行為學(xué)指標(biāo)。

抑郁是一種復(fù)雜的精神疾病，具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但增加5-HT水平，對(duì)改善抑郁癥狀有明確的療效。BDNF具有調(diào)節(jié)和保護(hù)5-HT和多巴胺能神經(jīng)元的作用，是兩種神經(jīng)元的重要調(diào)控物質(zhì)[9]，上調(diào)抑郁模型大鼠海馬區(qū)BDNF的表達(dá)可促進(jìn)5-HT的水平增加。 NO含量顯著增加，負(fù)反饋抑制四氫生物蝶呤的合成，進(jìn)而影響5-HT的生物合成，降低NO水平，可改善5-HT水平；而且NO能使HPA軸亢進(jìn)，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁；鉤藤總生物堿能通過HPA軸降低腫瘤壞死因子及NO的水平，明顯改善小鼠的抑郁行為[10]。因此改善抑郁小鼠的5-HT和BDNF，降低NO水平可明顯改善抑郁癥狀。除此，增加大鼠血清和皮質(zhì)部位GSH的水平，也可改善模型大鼠抑郁樣行為[11]。本研究結(jié)果表明，按本研究方法制備的兩受試物均能不同程度地改善上述因子水平，從而發(fā)揮一定的抗抑郁作用。

綜上，按本研究方法制備的青花椒和紅花椒提取物均表現(xiàn)出一定的抗抑郁作用，是篩選抗抑郁生物堿單體的理想原料。本研究的受試物為混合物，作用機(jī)制較復(fù)雜，清楚地闡明其抗抑郁機(jī)制比較困難，故只對(duì)其進(jìn)行了抗抑郁的初步評(píng)價(jià)。對(duì)其抗抑郁的具體機(jī)制，還有待于后期進(jìn)一步對(duì)兩受試物中的主要化學(xué)成分的分離以及各成分的藥理研究。