◎ 張 華，姜 慶，吳 迪，張 新

（臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000）

引起食源性疾病的致病菌很多，金黃色葡萄球菌是其中非常重要的一個，金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧食源性病原體，能夠在7.0～48.5 ℃、pH 4.2～9.3和NaCl濃度為0%～15%的這些外在因素中廣泛存在，且金黃色葡萄球菌很容易從各種食物中分離出來，如牛奶、乳制品、肉類和雞肉等，從而嚴重威脅著人們的身體健康[1-2]。根據(jù)《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[3]，其中九大類食品分別對金黃色葡萄球菌的限量進行了要求，充分體現(xiàn)了金黃色葡萄球菌在食品安全檢驗中是非常重要的一個指標。

盲樣考核是為了驗證實驗室檢測能力，確保日常檢測結(jié)果的準確可靠而必須進行的一項質(zhì)量控制活動。2021年8月，臨沂市檢驗檢測中心參加了由山東省食品藥品檢驗研究院組織的食品安全承檢機構(gòu)奶粉中金黃色葡萄球菌的定量檢測的盲樣考核活動，結(jié)果滿意，現(xiàn)將試驗過程及結(jié)果進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

盲樣考核樣品1份，編號為NFJP1606；在棕色西林瓶內(nèi)有0.5 g白色球狀樣品，避光儲存于-20 ℃內(nèi)；樣品中的含量水平為0～1.0×106CFU·g-1。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

Baird-Parker瓊脂，批號：190713；亞碲酸鉀卵黃增菌液，批號：201130；腦心浸出液肉湯（BHI），批號：190419；血平板，即用型培養(yǎng)基，批號：210725；凍干兔血漿，批號：201214；磷酸鹽緩沖液（貯存液），批號：201108；營養(yǎng)瓊脂，批號：200526，所使用的培養(yǎng)基都從北京陸橋技術股份有限公司購買且在保質(zhì)期內(nèi)；革蘭氏染色試劑盒；批號：6106229，從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司采購。

1.3 標準菌株

陰性對照菌為表皮葡萄球菌[CMCC（B）26069]，從中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心采購；陽性對照菌為金黃色葡萄球菌（ATCC 6538），從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心采購。

1.4 設備和耗材

ZGP-2270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海智誠公司）；MLS3780高壓蒸汽滅菌器（日本三洋公司）；TE212-L電子天平（賽多利斯公司）；微量移液槍（Gilson公司）；AC2-4S1生物安全柜（ESCD）、顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；XH-C快速混勻器（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 樣品前處理

依據(jù)《2021年承檢機構(gòu)盲樣考核作業(yè)指導書》，從-20 ℃冰柜中取出盲樣考核樣品NFJP1606，將西林瓶在室溫下放置5 min。在生物安全柜中進行無菌操作，樣品已按照0.5 g精確稱量后分裝，無需再稱量取樣，計算時按照0.5 g計算。加入4.5 mL滅菌PBS復溶后得到1∶10稀釋度的樣品勻液，然后進行10倍系列稀釋，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋梯度，每個稀釋度都使用新的無菌吸頭吸取前一稀釋度的樣品勻液，且吸頭不能碰觸樣品勻液液面。

1.5.2 樣品接種

根據(jù)此次盲樣考核作業(yè)指導書，樣品需至少進行3次重復測量，樣品中的含量水平為0～1.0×106CFU·g-1。選擇10-1～10-6稀釋度的樣品勻液。依據(jù)GB 4789.10—2016中第二法對樣品進行接下來的檢測。從每個稀釋度取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的樣品混勻液各加入到3塊B-P平板里，且每個稀釋度分別做3次重復，然后用無菌涂布棒涂布B-P平板，盡量在平板培養(yǎng)基中間區(qū)域涂布，避免涂布到平板邊緣。

1.5.3 培養(yǎng)

為了使涂布的樣品混勻液吸收，先把B-P平板正置，放在36 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)1 h，觀察到液體吸收后，再將B-P平板倒置，培養(yǎng)直至48 h。按照GB 4789.10—2016第二法的要求，對B-P平板上的典型菌落及可疑菌落進行計數(shù)，再進行血漿凝固酶試驗，按照陽性比例確定最終的計數(shù)結(jié)果[4]。

2 結(jié)果與分析

按照盲樣作業(yè)指導書和GB 4789.10—2016的要求，從10-1～10-6稀釋度進行取樣檢測，發(fā)現(xiàn)NFJP1606樣品中，在10-1、10-2、10-3稀釋度的平板里生長出只有一種特征的典型菌落，沒有其他可疑菌落生長。統(tǒng)計Baird-Parker平板上的典型菌落數(shù)見表1。

表1 Baird-Parker平板金黃色葡萄球菌典型菌落計數(shù)結(jié)果表

從B-P平板上挑取典型菌落劃線接種于血平板后，血平板上均出現(xiàn)了典型的金黃色葡萄球菌可疑菌落特征，對其進行革蘭氏染色鏡檢與血漿凝固酶試驗，結(jié)果見表2。

表2 選擇性分離平板菌落特征與鑒定結(jié)果表

金黃色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征符合金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)的典型特征。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄串狀，也有個別2個或3個球菌相連，無芽孢和莢膜，直徑大小為0.5～1.0 μm；接種于血平板上，是金黃色圓形菌落、光滑凸起濕潤、周圍有溶血圈，符合金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)的典型特征。

血漿凝固酶試驗必須設置對照試驗，以金黃色葡萄球菌標準菌株作為陽性對照，表皮葡萄球菌標準菌株作為陰性對照，以無菌生理鹽水作為空白對照。陽性對照培養(yǎng)3 h后凝固，陰性對照和空白對照培養(yǎng)6 h后仍未凝固[5]。盲樣考核樣品NFJP1606的典型菌落在培養(yǎng)3 h后全都凝固，判定為陽性結(jié)果。最終確認結(jié)果為 8.0×103CFU·g-1。

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核樣品，奶粉中金黃色葡萄球菌定量檢測的 B-P平板計數(shù)結(jié)果為8.0×103CFU·g-1，Z值小于2，為滿意結(jié)果。由此可見該實驗室具備金黃色葡萄球菌定量檢測能力。

目前，食品安全國家標準要求的金黃色葡萄球菌檢驗項目基本上都是定量檢驗，金黃色葡萄球菌的定量檢測是實驗室進行質(zhì)量控制盲樣考核的一項重要項目，有利于實驗室發(fā)現(xiàn)問題，從而改進工作，提高實驗室檢測水平，有效控制和判斷實驗室的檢驗檢測能力[6]。因此，在進行盲樣考核等試驗過程中，以下問題應該引起注意。①對接收到的樣品要認真進行檢查，確認是否完整，發(fā)現(xiàn)問題及時溝通。②試驗前認真閱讀作業(yè)指導書，作業(yè)指導書往往會對本次盲樣考核的樣品、試驗方法、結(jié)果記錄等會有特別要求，如本次盲樣考核要求樣品每個稀釋度做3次重復，和國家標準不一樣。③試驗前做好準備工作，包括儀器設備的校準、試運行，培養(yǎng)基試劑是否齊全；有條件可以購買指控樣品進行預試驗，提前發(fā)現(xiàn)問題并進行解決。④盲樣考核試驗要求非常精確，可以找一位經(jīng)驗豐富的監(jiān)督員，特別是對于新手而言，參加盲樣考核活動的機會少，防止出現(xiàn)操作失誤，影響考核結(jié)果。⑤定量檢測項目一般表明樣品范圍，可多做幾個稀釋度，確保結(jié)果準確，特別是在制作稀釋梯度時，9 mL的稀釋液要用無菌緩沖液分裝到無菌試管里，防止梯度稀釋液多少不均勻，影響結(jié)果的準確度。⑥Baird-Parker瓊脂平板的狀態(tài)對試驗結(jié)果影響較大，因此要使Baird-Parker平板表面保持干燥，發(fā)現(xiàn)Baird-Parker平板表面有水滴時一定要使平板表面完全干燥后，再進行涂布。⑦要盡快涂布Baird-Parker平板上的菌液，同時涂布棒在平板中間區(qū)域涂布，不要碰觸平板邊緣，避免引起菌落蔓延生長。⑧完成試驗后，因為涂布液含有奶粉不容易吸收，可先將平板正放在培養(yǎng)箱（36±1）℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置培養(yǎng)。⑨做好對照試驗，做血漿凝固酶試驗時，陽性對照、陰性對照和空白對照必須同時做好，按照標準要求每30 min觀察1次，觀察6 h。

盲樣考核能使實驗室管理者和實驗人員對實驗室的儀器設備和人員的檢驗能力有一個客觀的認識，是實現(xiàn)實驗室質(zhì)量控制的科學有效的技術方式，有利于實驗室自身能力的提高和檢驗檢測結(jié)果準確性、可靠性的提升。