張 苗 賀源方 謝冠群 徐 莉 范永升 陳 娟

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

上火是中醫(yī)學(xué)的專(zhuān)有名詞，是由“火熱之邪”侵襲人體造成的火熱病癥，臨床以口腔潰瘍、牙齦炎、鼻衄、咽痛口干、失眠癥、口臭、便秘等為典型癥狀[1]。根據(jù)“上火”虛實(shí)病機(jī)的不同，分為“實(shí)熱”上火和“虛熱”上火，前者屬“熱證”范疇，因體內(nèi)陰陽(yáng)消長(zhǎng)失衡，同時(shí)邪熱亢盛、內(nèi)外俱實(shí)所致[2]。牙齦炎患者常見(jiàn)胃火上炎，牙齦腫痛、出血，伴見(jiàn)口臭等癥。本研究采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記法，結(jié)合生物信息學(xué)用于牙齦炎及其常見(jiàn)“實(shí)熱”證的血清蛋白代謝特征研究，探討其科學(xué)內(nèi)涵，結(jié)合中醫(yī)學(xué)注重整體觀念的理論優(yōu)勢(shì)，不僅能豐富科學(xué)內(nèi)涵，而且對(duì)于防治“實(shí)熱”上火和改善人們的生活質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 資料采集

1.1 樣本來(lái)源：選取2016年2～6月就診于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科、口腔科、體檢中心的“實(shí)熱”上火牙齦炎患者16例和對(duì)照組健康人群17例。牙齦炎組（觀察組）年齡20～43(26.38±6.85)歲，其中男性8例，女性8例。對(duì)照組年齡21～39(28.06±5.53)歲，其中男性7例，女性10例。兩組人群年齡及性別均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：①以牙齦出血或齦齒間溢膿，牙齒松動(dòng)，影響咬嚼為主要癥狀。②緩慢起病，逐漸加重，嚴(yán)重者發(fā)展為全口牙齒松動(dòng)。病程中可有急性發(fā)作的牙周膿腫，局部紅腫熱痛，膿液量多，伴有發(fā)熱。③口腔檢查：牙齦紅腫或萎縮，易出血，牙根宣露，牙齒松動(dòng)。牙齒上附著牙垢、牙石。齦齒間有逐漸擴(kuò)大的牙周袋，袋內(nèi)溢膿。有口臭。④牙根周?chē)鶻線片示：牙槽嵴吸收、牙間隙增寬等表現(xiàn)。

1.3 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)1994年發(fā)布的中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》中牙宣（牙齦炎）診斷標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)熱型（胃火熾盛）：牙齦作痛、出血，口氣熱臭，渴喜冷飲，大便干結(jié)。牙齦紅腫疼痛，溢出膿血。舌紅、苔黃，脈數(shù)。

1.4 健康人群入選標(biāo)準(zhǔn)：①健康的正常人，無(wú)“上火”癥狀，符合平和質(zhì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。舌質(zhì)淡紅、苔薄白，脈緩和；②年齡在20～50周歲；③自愿參加本實(shí)驗(yàn)并簽署進(jìn)入臨床研究知情同意書(shū)者。

1.5 “實(shí)熱”上火牙齦炎患者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合“實(shí)熱”上火牙齦炎患者診斷標(biāo)準(zhǔn)；自愿參加本實(shí)驗(yàn)并簽署進(jìn)入臨床研究知情同意書(shū)者；年齡在20～50周歲。

1.6 排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者；合并各系統(tǒng)靶器官嚴(yán)重病變、精神病、腫瘤等疾病的患者；妊娠及哺乳期的婦女；研究中認(rèn)為有任何不適宜入選的情況。

2 方法

2.1 樣本采集：所有受試者入組后，采集清晨空腹血樣10ml，分裝于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝試管內(nèi)，立即混勻。2000r/min，l0min分離血漿后，轉(zhuǎn)移上層血漿至1.5ml離心管中。分裝后于-40℃冰箱保存待檢。

2.2 試劑與儀器：相對(duì)與絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（iTRAQ）試劑盒(Applied Biosys-tems，F(xiàn)oster city，CA，USA)，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO，USA),Labconco CentriVap冷凍離心濃縮儀(Labconco，USA)，Agilent MARS-14柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，Pierce?白蛋白/IgG去除試劑盒。

2.3 iTRAQ標(biāo)記：根據(jù)iTRAQ試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組血清樣品進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。使用Agilent MARS-14柱去除包括白蛋白、IgG和觸珠蛋白等在內(nèi)的14種高豐度蛋白，得到更多的低豐度蛋白富集，然后蛋白質(zhì)被濃縮和脫鹽，通過(guò)Bradford方法定量蛋白質(zhì)樣品的洗脫液。接著將蛋白質(zhì)樣品還原，烷基化，最后用胰蛋白酶在37℃下消化過(guò)夜。

2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析：通過(guò)Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程。蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)通過(guò)STRING（http：//stringdb.org/）進(jìn)行分析。利用基因組學(xué)途徑數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/mapper.html)進(jìn)行路徑分析。采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均值間差異比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清差異蛋白定量分析：基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LCMS/MS技術(shù)篩選對(duì)照組與“實(shí)熱”上火組差異蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次并將兩次鑒定結(jié)果合并，選取overlap部分，通過(guò)對(duì)方差分析(Aov分析)，卡值后的差異蛋白數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，篩選到觀察組與對(duì)照組間43個(gè)差異表達(dá)蛋白(P＜0.05)，其中上調(diào)蛋白27個(gè)(倍率＞1.25,見(jiàn)表1)，下調(diào)蛋白16個(gè)(倍率＜0.8,見(jiàn)表2)。

表1 “實(shí)熱”上火牙齦炎人群血漿上調(diào)的差異蛋白質(zhì)

表2 “實(shí)熱”上火牙齦炎人群血漿下調(diào)的差異蛋白質(zhì)

3.2 血漿差異蛋白生物信息學(xué)分析：GO富集分析顯示對(duì)照組和“實(shí)熱”上火牙齦炎組差異化蛋白主要參與血小板激活、急性炎癥反應(yīng)、體液免疫應(yīng)答、血液凝固(圖1A)。此外差異蛋白集中定位于血液微粒、血小板α顆粒、高密度脂蛋白粒子、血漿脂蛋白粒子(圖1B)。功能富集分析表明絕大多數(shù)蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解、應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和凋亡中起著至關(guān)重要的作用(圖1C)。KEGG通路分析(圖2)后，根據(jù)富集的結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集在細(xì)胞吞噬、凝血和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)、炎癥感染等通路。通過(guò)STRING蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)展現(xiàn)得到的蛋白質(zhì)之間整個(gè)的網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)圖集中指向纖溶-凝血-補(bǔ)體系統(tǒng)，以及脂質(zhì)代謝異常。

圖1 “實(shí)熱”上火牙齦炎差異蛋白GO功能富集分析

圖2 “實(shí)熱”上火牙齦炎血漿差異蛋白KEGG通路分析

圖3 STRING軟件分析的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)作用圖

4 討論

“上火”的病因病機(jī)較為復(fù)雜，其形成與發(fā)展必然會(huì)引起臟腑功能失調(diào)以及機(jī)體物質(zhì)代謝水平的紊亂。C反應(yīng)蛋白(CRP)在肝臟中合成，是血漿中的主要蛋白質(zhì)[4]。其參與免疫反應(yīng)，是先天免疫反應(yīng)的一部分。因此常常作為診斷感染的生物學(xué)指標(biāo)。

載脂蛋白是一類(lèi)家族較龐大的蛋白，能夠結(jié)合和運(yùn)輸血脂到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝及利用。載脂蛋白(APO)D可以參與脂質(zhì)運(yùn)輸、食物攝取、炎癥、抗氧化反應(yīng)，APOD與高密度脂蛋白的相關(guān)性最強(qiáng)，與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白(LDL和VLDL)的相關(guān)性較低[5]。有研究表明APOD的神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用可能源于它將花生四烯酸(AA)穩(wěn)定在細(xì)胞膜上或?qū)⑵涓綦x，從而阻止其轉(zhuǎn)化為促炎分子[6]。HDL被認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化的物質(zhì)，載脂蛋白C-II是高密度脂蛋白(HDL)的組成成分。載脂蛋白M具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎特征，主要作用于HDL，其對(duì)于HDL的形成至關(guān)重要[7]。HDL可以通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，減少內(nèi)皮活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而防止內(nèi)皮的促炎反應(yīng)。但有研究證明，它們的生物學(xué)特性可以通過(guò)血清淀粉樣蛋白A(SAA)的積累而改變。添加了SAA的HDL減少了內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生，SAA可以將HDL轉(zhuǎn)化為促炎顆粒，從而刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化[8]。研究發(fā)現(xiàn)“實(shí)熱”上火牙齦炎組C反應(yīng)蛋白(CRP)、載脂蛋白D、載脂蛋白M、載脂蛋白C-II和血清淀粉樣蛋白A(SAA)的上調(diào)，說(shuō)明對(duì)照組的脂質(zhì)代謝異常，抗炎能力下降，抗氧化能力降低，且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集在凝血與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路。此通路是內(nèi)源性凝血激活途徑和經(jīng)典補(bǔ)體激活的重要途徑。凝血因子X(jué)II(FXII)是一種蛋白酶，與帶負(fù)電的表面接觸后，F(xiàn)XII轉(zhuǎn)換為兩鏈活性形式FXIIa。FXIIa通過(guò)激活XI因子來(lái)啟動(dòng)內(nèi)在的凝血途徑。此外，F(xiàn)XIIa通過(guò)PK介導(dǎo)的尿激酶激活來(lái)啟動(dòng)纖維蛋白溶解，并激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑[9]。補(bǔ)體的過(guò)度(異常)活化可以引起炎性反應(yīng)及組織損傷[10]。因此，可以推斷差異蛋白凝血因子X(jué)II、補(bǔ)體C1r、C1s升高，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致凝血功能下降，造成牙齦出血。

在下調(diào)的差異蛋白中，我們發(fā)現(xiàn)一種蛋白α-1抗胰蛋白酶。它是血液循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有保護(hù)細(xì)胞、阻止細(xì)胞凋亡的作用[11]。熱休克蛋白可保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)免受熱休克、毒性、缺氧和炎癥的影響[12]。微管蛋白是微管(細(xì)胞骨架)的主要成分[13]。細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)和組織穩(wěn)定性以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞增殖和細(xì)胞通訊中起著基本作用[14]。我們發(fā)現(xiàn)，微管蛋白β微管蛋鏈在“實(shí)熱”上火牙齦炎組中被上調(diào)，推測(cè)牙齦炎與細(xì)胞骨架紊亂密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)“實(shí)熱”上火牙齦炎的癥狀可能通過(guò)凝血-補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路引起，信號(hào)通路上的差異蛋白可以作為“實(shí)熱”上火牙齦炎基礎(chǔ)研究的潛在靶點(diǎn)。另外一些急性相蛋白、載脂蛋白合并血清淀粉樣蛋白A(SAA)的變化；α-1抗胰蛋白酶、熱休克蛋白、微管蛋白β胰蛋白下調(diào)會(huì)引起抗氧化能力降低，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，破壞細(xì)胞形態(tài)。本研究為牙齦炎的臨床診斷和中西醫(yī)治療提供了參考，也為實(shí)熱“上火”表征的另一路徑或靶向治療提供了科學(xué)依據(jù)。