鄭 婭 董其武 王兆婷

寧波市康復醫(yī)院 浙江 寧波 315040

缺血性腦卒中在我國腦卒中患者數(shù)量中居首位?；颊呷巳褐?，老年人占比最大，給國家經(jīng)濟帶來了較重的負擔[1-2]。臨床上以抗血小板凝集、強化降脂等治療方法為主，雖已取得了較好的療效，但早期復發(fā)率高達30%，且伴隨著高致死率和高致殘率，所以減輕其復發(fā)率是現(xiàn)如今研究的重點。治療該疾病的根本是對缺血部位及時恢復供血[3-4]，一些研究結果顯示，對腦缺血部位及時供血雖可恢復缺血部位的正常功能，不過也會造成腦缺血再灌注損傷（CIRI）[5]。因此，尋找價格低廉、切實有效的防治CIRI的藥物是目前研究的熱點。

腦卒中可歸屬于中醫(yī)學“中風”范疇[6]。地黃飲子（DY），為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，其藥物組成為熟地黃、白茯苓、麥門冬、石菖蒲、附子、五味子、官桂、遠志、山茱萸、石斛、肉蓯蓉等，在臨床上防治腦卒中效果較好[7-9]。地黃飲子在動物實驗中有較好的表現(xiàn)，對于CIRI所引發(fā)的神經(jīng)損傷有一定的緩解作用，使腦梗死率降低，緩解腦卒中病理改變[10-11]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注模型大鼠血小板LC3、Beclin1蛋白顯著增加，地黃飲子干預后能有效降低自噬水平?；诖耍緦嶒炦M行進一步探究，研究地黃飲子是否通過減輕血小板自噬降低CIRI的損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：從上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買的50只40周雄性SD大鼠，體質量500～700g，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0008，在杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心飼養(yǎng)，動物使用SYXK許可證號（浙）2020-0024。實驗前適應性飼養(yǎng)，室溫為22±2℃，相對濕度為60%。

1.2 實驗材料與試劑：地黃飲子，由本院中藥房提供。其方劑組成：熟地黃18g，茯苓、山茱萸、肉蓯蓉各12g，麥門冬、石斛、巴戟天各10g，遠志9g，石菖蒲8g，五味子6g，附子、肉桂、薄荷各4g，生姜3g，大棗5個。以上中藥浸泡在5倍體積的水中45min，后在沸騰溫度下煎煮半小時，取出煎液。在3倍體積的水中繼續(xù)煎煮兩次，最后將湯液全部收集，過濾，濃縮至2g/ml，4℃冰箱保存。Beclin-1、Phospho-IKB epsilon(Ser161)、LC3 A/B、APG5L/ATG5、GAPDH、CD62P Antibody（批號：AF5128、AF3002、AF5402、DF6010、AF1027、DF13294，江蘇親科生物研究中心有限公司）；組化試劑盒AEC顯色劑（批號：G1211，武漢塞維爾生物科技有限公司）；大鼠β血小板球蛋白/β血栓環(huán)蛋白(β-TG)、大鼠血小板因子4(PF-4/CXCL4)ELISA試劑盒（批號：MM-0531R1、MM-0083R1，江蘇酶免實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗儀器：從Leica購入RM2235型石蠟切片機、DM3000型正置熒光顯微鏡，從Thermo購入Micro17R型低溫高速離心機，從上海徠卡儀器有限公司購入RM2016型病理切片機，從雅培公司購入C16000型全自動生化檢測儀。

1.4 CIRI模型構建及實驗分組：大鼠常規(guī)麻醉備皮，于頸中部剪開，分離左側頸總動脈及頸外動脈；對左側頸總動脈進行結扎并于頸總動脈剪一小口,插入線栓，當有阻力產(chǎn)生時停止操作，約18mm，扎緊固定、縫合，90min后退出線栓，實現(xiàn)再灌注。假手術組不進行栓塞便縫合傷口，其余同手術組。在實驗過程中檢查并保持實驗大鼠體溫在37±0.6℃。術后第1d起，將大鼠分為假手術組、模型對照組（CIRI組）、CIRI+DY 6g/kg組、CIRI+DY 12g/kg組、CIRI+尼莫地平10mg/kg組（n=10）。按照劑量配比進行地黃飲子及陽性對照藥灌胃處理，假手術組給予等體積生理鹽水，實驗開展28d。

1.5 HE染色：將大鼠腦組織樣本分離出來，在多聚甲醛中進行固定，脫水、包埋、切片后進行HE染色，鏡檢。采集分析樣本相關部位，同時根據(jù)腦細胞形態(tài)結構與細胞周圍情況進行打分：正常為0分；少量細胞損傷，細胞周圍無空泡為1分；細胞明顯損傷，空泡少為2分；細胞損傷明顯，空泡明顯為3分；細胞嚴重損傷，出現(xiàn)大量空泡為4分，并進行記錄。

1.6 TTC染色：取麻醉后大鼠的新鮮腦組織，經(jīng)速凍、解凍、切片后放入37℃的TTC孵育液中，避光操作孵育0.5h，顯微鏡下觀察。

1.7 腦水腫檢測：解剖大鼠大腦同側和對側半球，并測定組織的濕重。將組織在120℃下干燥24h。腦水百分比=（濕重—干重）/干重×100%。

1.8 Western blot檢測：提取大鼠腦組織蛋白，測定總蛋白的濃度，電泳，轉PVDF膜，TBST洗膜。行免疫印跡反應，封閉液封閉，加含一抗稀釋液，4℃過夜進行孵育，棄一抗，加二抗，在搖床上振蕩反應1h，回收二抗，TBST洗膜。以GADPH為內參，化學發(fā)光儀顯影，chemi capture軟件分析圖像，測定各組大鼠腦組織中Beclin-1、Atg5、LC3的蛋白表達。

1.9 免疫組化檢測：石蠟切片進行組織抗原修復，之后進行過氧化物酶阻斷并進行封閉，加入一抗后加二抗，進行顯色、封片、鏡檢。

1.10 ELISA檢測：按照ELISA試劑盒說明測定大鼠血清中β-TG和PF4的含量。

1.11 統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計分析軟件利用SPSS 16.0，One-way-ANOAY單因素方差分析用于計量資料多組間的比較，SNK分析用于組間比較。Kruskal-Wallis H用來檢驗方差不齊者。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 地黃飲子對CIRI大鼠大腦皮層組織病理學變化的影響：見圖1。與假手術組相比，CIRI組大鼠神經(jīng)細胞數(shù)量顯著減少，排列不規(guī)則，細胞核固縮出現(xiàn)大量壞死細胞，HE半定量評分顯著減少；與CIRI組相比，CIRI+DY 6g/kg組大鼠神經(jīng)元細胞固縮有所改善，CIRI+DY 12g/kg組大鼠腦組織病理學損害有所減輕，壞死細胞明顯減少，CIRI+尼莫地平10mg/kg組大鼠細胞固縮改善情況最明顯，同時CIRI+DY 12g/kg組與CIRI+尼莫地平10mg/kg組HE半定量評分極顯著降低。見表1。

圖1 大鼠大腦皮層組織病理學改變

表1 大鼠大腦皮層組織HE半定量評分表（±s，n=6）

表1 大鼠大腦皮層組織HE半定量評分表（±s，n=6）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與CIRI組比較，##P＜0.01。

半定量評分0.00±0.00 3.33±0.52**3.17±0.41 1.50±0.55##1.33±0.52##組別假手術組CIRI組CIRI+DY 6g/kg組CIRI+DY 12g/kg組CIRI+尼莫地平10mg/kg組

2.2 CIRI大鼠腦梗死面積的變化：如圖2，相較于假手術組，CIRI組大鼠腦白色梗死區(qū)域顯著增多，梗死率升高（P＜0.01）；與CIRI相比，CIRI+DY 6g/kg組、CIRI+DY12g/kg組與CIRI+尼莫地平10mg/kg組大鼠腦梗死面積顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖2 CIRI大鼠腦梗死率（±s，n=6）

2.3 地黃飲子對CIRI大鼠腦水腫情況的影響：與假手術組比較，CIRI組大鼠腦含水量極顯著上升（P＜0.01）；與CIRI組比較，CIRI+DY 12g/kg和CIRI+尼莫地平10mg/kg組大鼠腦含水量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），見圖3。

圖3 大鼠腦含水量情況（±s，n=6）

2.4 地黃飲子對CIRI大鼠腦組織中Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白表達情況的影響：相較于假手術組，CIRI組大鼠的腦組織中三種蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；相較于CIRI組，CIRI+DY 12g/kg組與CIRI+尼莫地平10mg/kg組三種蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 大鼠腦組織中Beclin-1、Atg5、LC3蛋白表達條帶圖（± s，n=4）

2.5 地黃飲子對CIRI大鼠CD62P含量的影響：見圖5。與假手術組比較，CIRI組大鼠CD62P的含量呈現(xiàn)出升高的趨勢（P＜0.01）。CIRI+DY 12g/kg組、CIRI+尼莫地平10mg/kg大鼠腦組織中CD62P的蛋白表達量與CIRI組相比較顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 免疫組化檢測腦組織CD62P的表達情況（±s，n=4）

2.6 地黃飲子對CIRI大鼠血清中β-TG和PF4含量的影響：從圖6可以看出CIRI組β-TG和PF4含量與假手術組比較均有所升高（P＜0.01）；β-TG和PF4的含量與CIRI組比較降低的是CIRI+DY 12g/kg和CIRI+尼莫地平10mg/kg組（P＜0.01或P＜0.05）。

圖6 大鼠血清中β-TG和PF4的含量（±s，n=6）

3 討論

CIRI發(fā)生后可促使一系列級聯(lián)反應的發(fā)生，對腦組織及神經(jīng)帶來再次損傷，影響腦部正常功能。多年來，對于CIRI的預防和治療雖然得到了較大的改善，但相關的分子生物學機制尚未明晰。臨床上用于CIRI以藥物治療為主，包括西藥，中藥有效成分、提取物或復方以及針灸療法[12]。地黃飲子為經(jīng)典名方目錄入選方，對CIRI治療效果較好，且有大量相關臨床數(shù)據(jù)佐證[13]。研究顯示，地黃飲子能夠從抑制細胞自噬層面發(fā)揮作用，從而使腦神經(jīng)細胞增殖加快、抑制細胞的氧化反應等多種反應途徑和機制來減輕腦組織損傷[14]。本研究結果顯示，在CIRI老齡大鼠模型中，地黃飲子可明顯改善缺血再灌注對腦組織的病理學損傷，減少細胞壞死和核固縮現(xiàn)象，并有效減少腦缺血造成的腦梗死和腦水腫。

細胞自噬是一種在基因調控下通過溶酶體對體內受損細胞和大分子、細胞器進行清除轉化成供機體利用的物質的作用過程。在以往出生的新生大鼠中，出現(xiàn)缺氧情況就會導致自噬相關蛋白表達水平升高，而這些蛋白主要包括LC3、Beclin-1[15-17]，表明缺血導致的腦損傷與細胞自噬有一定的相關性。在自噬過程中，LC3的羧基末端脂質修飾即LC3Ⅱ的增加是自噬體形成所需的特征性表現(xiàn)，在以往研究中發(fā)現(xiàn)CIRI大鼠腦組織自噬標志蛋白LC3、Beclin-1顯著增加，而地黃飲子的干預能有效降低自噬水平。本實驗也更好地驗證了這一點，通過Western blot實驗可以直觀地反映出CIRI組大鼠腦組織中Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白表達顯著升高，而在加入地黃飲子后的CIRI+DY 12g/kg組Beclin-1、LC3 II/LC3 I和Atg5蛋白的表達水平均顯著降低，提示地黃飲子干預后確能有效降低腦組織細胞的自噬水平，使缺血側腦組織病理損傷程度減輕，發(fā)揮神經(jīng)功能保護性作用。

血小板內靜息信息調節(jié)劑2同系物1（SIRT1）通過蛋白酶體和溶酶體途徑抑制體外血小板聚集和血栓形成。已知在含有SIRT1和肝激酶B1的胞質復合物中（Liver kinase B1，LKB1），AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的激活受 LKB1調節(jié)，SIRT1是LKB1去乙?；图せ钏璧腫18]。AMPK和哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）這兩種信號分子又呈相互拮抗的時向關系?？梢娫谘“逯蠸IRT1-AMPK-mTOR信號通路抑制了自噬。β-TG和PF4與血小板α顆粒有著密切的關系，當血小板活化水平升高，β-TG和PF4的濃度就會隨之增加。有研究評估了分支動脈粥樣硬化性腦梗死患者β-TG和PF4的水平，發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血小板活性通常升高[19]。其他相關研究中也指出，凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)以及Tem失衡也會引起腦血栓，CD62P是一種位于血小板上的糖蛋白，對血小板的黏附有一定的介導作用，同樣可以反映血小板活化水平。在一項268例病例的研究中發(fā)現(xiàn)，CD62P的水平以重度腦梗死患者最高[20]。在本研究中，與CIRI組比較，CIRI+DY 12g/kg組大鼠腦組織中CD62P的蛋白表達量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），大鼠血清中β-TG和PF4的含量顯著降低（P＜0.05）。這表明地黃飲子抑制了血小板的活化及聚集，并降低了血小板的黏附功能。

綜上所述，本研究表明在CIRI大鼠模型中，地黃飲子對于減輕CIRI有重要作用，其作用機制可能是通過抑制血小板活化及自噬途徑，進而下調血小板聚集和血栓形成等過程實現(xiàn)的。