張蓬勃，宋艷玲

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid，OA，圖1)又稱土當歸酸、四慶素，是天然分布十分廣泛的五環(huán)三萜類化合物，在齊墩果、青葉膽、獐牙菜、大星芹、女貞子、大籽雪膽、楤木中以糖苷或游離態(tài)的形式存在.齊墩果酸是一種極具研究價值的天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗微生物等.但由于齊墩果酸母核剛性較強、骨架可塑性較低、且本身水溶性較差等原因，導致齊墩果酸的生物利用性較差，較大劑量服用會導致膽囊水腫.故對齊墩果酸母核進行結(jié)構(gòu)修飾，通過引入具有一定生物活性的化學片段，以期提高生物活性，增強藥理作用[1-5].

人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤是成人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性神經(jīng)上皮性腫瘤，嚴重影響著人類的健康生活.Narciclasine(圖1)對人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤具有較強抑制作用，IC50值為50 nmol/L.1mg/kg劑量的Narciclasine能明顯提升GL19多形性膠質(zhì)母細胞瘤小鼠的存活率(存活率P=0.002)，其作用機制可能是通過激活多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞中的Rho蛋白和應力纖維[6-7].構(gòu)效關(guān)系研究表明，其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)是產(chǎn)生抗腫瘤活性的重要藥效基團.因此,對齊墩果酸母核A環(huán)進行結(jié)構(gòu)改造，通過A環(huán)擴環(huán)并引入內(nèi)酰胺片段，設計并合成新型齊墩果酸衍生物.

圖1 齊墩果酸及Narciclasine化學結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600型核磁共振儀,美國Bruker公司；Büchi B-540熔點測定儀,瑞士Büchi公司；薄層色譜(GF-254)、柱色譜硅膠(200～300目),青島海洋化工有限公司；齊墩果酸(質(zhì)量分數(shù)98%),陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；氟硼酸鋅水合物,上海易恩化學技術(shù)有限公司；鹵代烷烴類藥品,上海麥克林化學試劑有限公司；其他溶劑和藥品均為分析純.

1.2 合成實驗

OA衍生物的合成路線見圖2.以齊墩果酸為原料，將C-3位羥基氧化為羰基生成化合物1，再通過C-3位羥肟化得到化合物2，化合物2通過貝克曼重排反應得到化合物3，再通過C-28位酯化反應得到目標化合物.

a Jone試劑,丙酮,異丙醇,0 ℃ b 鹽酸羥胺,吡啶,50 ℃ c 氟硼酸鋅水合物,乙腈,100 ℃ d 碳酸鉀,鹵代烷,N,N-二甲基甲酰胺,室溫

1.2.1 3-羰基-齊墩果酸(1)的制備

將齊墩果酸1.000 g、2.189 mmol溶于50 mL無水丙酮溶液中，冰浴條件下緩慢滴加Jones試劑2.5 mL，滴加完畢后撤除冰浴，室溫下反應3 h，TLC監(jiān)測反應.反應完畢，加入60 mL異丙醇淬滅.反應結(jié)束后，減壓除去溶劑，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，無水乙醇重結(jié)晶，得白色晶體化合物(1) 0.86 g，產(chǎn)率為86.45%，mp 186～187 ℃(文獻mp 185～186 ℃)[8].

1.2.2 3-羥肟基-齊墩果酸(2)的制備

將3-羰基-齊墩果酸(0.800 g，1.761 mmol)溶于20 mL無水吡啶溶液中，加入鹽酸羥胺(0.551 g，7.924 mmol)，50 ℃油浴條件下反應4 h，TLC監(jiān)測反應.反應結(jié)束后加入適量二氯甲烷溶液稀釋，用體積分數(shù)為10%的鹽酸洗滌3次，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(2) 0.668 g，產(chǎn)率為80.75%，mp 236～238 ℃.

1.2.3 化合物3的制備

將3-羥肟基-齊墩果酸(0.500 g，1.064 mmol)溶于20 mL無水乙腈溶液中，加入氟硼酸鋅水合物(0.025 g，0.106 mmol)，100 ℃下回流反應3 h，TLC監(jiān)測反應.反應結(jié)束后加入適量二氯甲烷稀釋，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干，得白色固體化合物(3) 0.258 g，產(chǎn)率為51.60%，mp 228～231 ℃.

1.2.4 化合物Ⅰ1的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入碘甲烷(0.091 g，0.638 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌反應2 h，TLC監(jiān)測反應.反應結(jié)束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯，得到白色固體產(chǎn)物化合物(Ⅰ1)0.107g，產(chǎn)率為66.49%，mp 252～255 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO),δ:7.55(s,1H,CONH),5.29(s,1H,H-12),3.63(s,3H,CH3),1.52(s,3H,CH3),1.50(s,3H,CH3),0.97(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.82(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.5 化合物Ⅰ2的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入溴乙烷(0.069 g，0.638 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌反應2 h，TLC監(jiān)測反應.反應結(jié)束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯,得到白色固體產(chǎn)物化合物(Ⅰ2) 0.103 g，產(chǎn)率為64.86%，mp 258～259 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO)，δ:7.58(s,1H,CONH),5.25(s,1H,H-12),4.28(m,2H,—CH2),1.52(s,3H,CH3),1.51(s,3H,CH3),1.27(s,3H,CH3),0.98(s,3H,CH3),0.92(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.83(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.2.6 化合物Ⅰ3的制備

將化合物3(0.150 g，0.319 mmol)和無水碳酸鉀(0.110 g，0.798 mmol)溶于20 mL干燥的DMF溶液中，攪拌下緩慢加入溴丙烷(0.078 g，0.638 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌反應2 h，TLC監(jiān)測反應.反應結(jié)束后加水稀釋，乙酸乙酯萃取，飽和NaCl溶液洗滌3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，抽濾，減壓蒸干溶劑，硅膠柱層析分離(200～300目)，洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯，得到白色固體產(chǎn)物化合物(Ⅰ3) 0.982 g，產(chǎn)率為60.15%，mp 280～283 ℃.1H-NMR(600 MHz,DMSO)，δ:7.57(s,1H,CONH),5.28(s,1H,H-12),4.21(m,2H,—CH2),1.78(m,3H,—CH2),1.52(s,3H,CH3),1.50(s,3H,CH3),1.08(s,3H,CH3),0.97(s,3H,CH3),0.93(s,3H,CH3),0.91(s,3H,CH3),0.82(s,3H,CH3),0.80(s,3H,CH3).

1.3 抗腫瘤活性實驗

以Narciclasine為陽性對照藥，取對數(shù)生長期的人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞(BT-325)和人肝癌細胞(HepG2)，以每孔5×103個接種于96孔板內(nèi)，每組3個復孔，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用.待細胞貼壁后，分別加入待測化合物，藥品濃度為10 μmol/L，空白組為陰性對照組，Narciclasine為陽性對照組.培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h.加入MTT溶液(5 g/L，20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去每孔上清液，加入二甲基亞砜200 μL，震蕩器上震蕩5 min，然后用酶標儀于570 nm處測OD值，重復3次實驗，取平均值，計算所測化合物對腫瘤細胞的抑制率.使用Gragphpad軟件計算IC50值.

2 結(jié)果與討論

目標化合物Ⅰ1～Ⅰ3、OA和Narciclasine對人腦多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞(BT-325)和人肝癌細胞(HepG2)抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)值見表1.

表1 化合物對BT-325和HepG2細胞株的抗腫瘤活性

體外抗腫瘤活性測試結(jié)果表明：目標化合物Ⅰ1—Ⅰ3對BT-325和HepG2兩種腫瘤細胞株都體現(xiàn)出了一定的生長抑制作用，均高于先導化合物齊墩果酸.其中化合物Ⅰ1對BT-325細胞的抑制活性最好(抑制率=50.3%，IC50=17.1 μmol/L).通過初步構(gòu)效關(guān)系研究表明：隨著C-28位酯基取代基碳鏈的延長，化合物對BT-325和HepG2細胞的抑制活性降低.這是因為隨著碳鏈延長，可能使化合物空間位阻增大，從而影響其生物活性.

在目標化合物的合成過程中，對化合物3的合成反應條件進行優(yōu)化與改進.在非均相鋅催化體系下進行酮和鹽酸羥胺的貝克曼重排反應[9-11].與傳統(tǒng)高溫和強酸條件下的貝克曼重排反應相比，反應操作簡單，反應選擇性高，收率高、反應廢液少，反應原子經(jīng)濟性較高，符合綠色化學要求.同時考查反應溫度和反應時間對收率的影響.按照不同的反應溫度(90℃，100℃，110℃和120℃)進行實驗，通過TLC監(jiān)測反應終點，考察溫度對反應時間與反應收率的影響：當反應溫度為90 ℃時，反應時間6 h，TLC監(jiān)測反應完全，收率為50%;當反應溫度為100 ℃時，反應時間3 h，TLC監(jiān)測反應完全，收率為60%;當反應溫度為100～110 ℃時，收率未見提高.因此,反應最適溫度為100 ℃.考查反應溫度100 ℃下反應時間對收率的影響，反應時間2 h時，反應未完全，反應時間為3 h，反應完全，繼續(xù)延長反應時間，反應產(chǎn)率降低.結(jié)果表明反應時間過長，可能造成部分產(chǎn)物分解，降低反應產(chǎn)率.

3 結(jié) 論

設計并合成了3個新型齊墩果酸衍生物.體外腫瘤細胞抑制活性測試結(jié)果表明:目標化合物對BT-325和HepG2腫瘤細胞均有明顯的生長抑制作用，均優(yōu)于先導化合物OA.構(gòu)效關(guān)系表明:將齊墩果酸A環(huán)改造為七元內(nèi)酰胺環(huán)能顯著提高其抗腫瘤活性.本研究結(jié)果對齊墩果酸衍生物的進一步優(yōu)化設計具有一定的參考意義.