王家彬，潘 力

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

腸道微生物主要指定植于腸道內(nèi)的微生物菌群，其數(shù)量與人類細胞的數(shù)量相似。利用人類糞便樣品的微生物測序和動物模型中的腸道微生物移植，腸道微生物群與人類健康和疾病的關(guān)系開始被眾人所知。乳酸菌是一類可將糖類發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乳酸的革蘭氏陽性菌，作為人體腸道內(nèi)的正常菌群一員，可以很容易地作為天然功能性食品納入基本飲食，因此也被越來越多地用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)，而且它們已被證明能夠有效地改善胃腸健康和某些代謝綜合征，包括糖尿病和精神類疾病等。

高尿酸血癥是臨床上最常見也是危害最大的慢性疾病之一，其典型特征是尿酸形成增加或尿酸排泄減少。血液中尿酸含量的升高會增加患痛風和心血管疾病、糖尿病、肥胖和慢性腎臟病的風險。此外，高尿酸血癥也可能影響腸道微生物體內(nèi)平衡和腸道上皮完整性。治療高尿酸血癥的關(guān)鍵是降低尿酸濃度?，F(xiàn)行治療手段除以藥物治療之外，一般都要輔以嚴格的飲食控制，盡可能減少外源性嘌呤類物質(zhì)攝入。在臨床常用的治療高尿酸血癥藥物主要包括別嘌呤醇（黃嘌呤氧化酶抑制劑）和苯溴馬?。ㄒ种颇I尿酸鹽的重吸收）。由于本病發(fā)病機制復雜，并且服藥的同時還需嚴格控制飲食，患者治療依從性不髙。因此，如何利用乳酸菌參與高尿酸血癥的預防和治療成為當前的熱點之一。已有研究表明，某些乳酸菌可以通過降解或者吸收核苷競爭性減少腸道上皮對核苷的吸收，從而減少尿酸的生成。金方等研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌ZM15能夠在體外降解核苷酸與核苷，同時在體內(nèi)可能通過與腸道上皮細胞競爭吸收相應(yīng)核苷酸與核苷，使模型大鼠的血尿酸水平顯著降低。由于尿酸在產(chǎn)生過程中，其前體物質(zhì)依次為黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷/鳥苷、核苷酸等，其含量均與最終血液中的尿酸含量有關(guān)。有研究表明，乳酸菌無法降解尿酸和嘌呤類物質(zhì)（黃嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤），而核苷攝取是嘌呤和嘧啶進入腸上皮細胞的主要途徑，因而提前降解核苷便是乳酸菌調(diào)節(jié)血尿酸的主要作用方式。目前有一些研究人員通過這種原理篩選降尿酸的菌株，本研究選用相同的原理篩選潛在降尿酸的菌株。有研究表明乳桿菌DM9218可以治療高果糖誘導的腸道失調(diào)的小鼠，檢測到DM9218能夠降低果糖喂養(yǎng)小鼠的血清尿酸水平和黃嘌呤氧化酶活性，起到了治療作用。然而，目前關(guān)于乳酸菌調(diào)節(jié)尿酸的研究還相對較少，乳酸菌在高尿酸血癥中的應(yīng)用前景還沒有得到廣泛探索。因此，尋找高效的天然降尿酸乳酸菌，豐富國內(nèi)降尿酸乳酸菌的菌種庫，成為當前重要的任務(wù)。

本研究首先以國內(nèi)外的特色食源性物質(zhì)為來源，通過傳統(tǒng)分離方法和分子生物學鑒定方法（16S rDNA序列分析法）相結(jié)合，分離篩選乳酸菌株。之后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法體外評價收集得到的乳酸菌株對肌苷和鳥苷的降解作用，從而篩選具有潛在降尿酸能力的菌株。然后，通過在體外建立黃嘌呤氧化酶篩選模型評價菌株的黃嘌呤氧化酶抑制能力，最終篩選到1 株同時具有高效核苷降解和黃嘌呤氧化酶抑制能力的菌株。本實驗旨在豐富我國在降血尿酸乳酸菌的菌種庫，為乳酸菌制劑及其功能性產(chǎn)品的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為開發(fā)預防和治療高尿酸血癥藥物提供理論基礎(chǔ)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品為采集自國內(nèi)外不同地區(qū)的特色食源性物質(zhì)，包括菌種類產(chǎn)品（喜他康、SWASON）、自制泡菜、貴州白酸湯和國內(nèi)酸奶（簡愛、香滿樓）。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色試劑 廣州環(huán)凱生物科技有限公司；DreamGreen PCR Master Mix 諾唯贊生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司；引物由天一輝遠（廣州）基因科技有限公司合成；肌苷、鳥苷、別嘌呤醇、別嘌呤醇、NaClO、HPO、KPO、HClO（HPLC級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液

MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、吐溫80 1.08 g/L、MnSO·4HO 0.05 g/L、MgSO·7HO 0.2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉提取物10 g/L、酵母提取物4 g/L、KHPO2 g/L（pH 5.7±0.2）。固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂。所有材料在使用前121 ℃滅菌20 min。

HPLC流動相：稱取0.122 5 g NaClO，加入1 000 mL容量瓶中并以超純水定容，振蕩混勻。吸取100 μL高氯酸鈉溶液，加入預先盛有200 mL超純水的HPLC流動相儲存瓶中，另取10 mL HPO（色譜級），緩緩加入HPLC流動相儲存瓶中，充分振蕩，補足至1 000 mL，在搖床內(nèi)以180 r/min振蕩混勻10 min。最終流動相組成為0.1 μmol/L NaClO-0.187 mol/L HPO-dd HO。

黃嘌呤氧化酶液的制備：將黃嘌呤氧化酶（100 U）用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.5）溶解為0.5 U/mL，置于4 ℃保存。

黃嘌呤底物的制備：底物黃嘌呤先用少量0.1 mol/L NaOH溶液超聲溶解，再用0.2 mol/L PBS（pH 7.5）定容成2 mmol/L黃嘌呤底物溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；光學顯微鏡 德國ZEISS公司；移液槍、高速離心機 德國Eppendorf公司；浸入式水平電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 1000紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；M200多功能酶標儀 德國Tecan公司；1220 Infinity HPLC裝置 美國Agilent公司；Athena C-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 德國CNW公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌株的分離純化

1.3.1.1 乳酸菌株的初篩

取出之前保存在4 ℃冰箱中的樣品，在超凈臺中加入0.1 g菌粉類樣品到含有1 mL無菌生理鹽水的EP管中，使其完全溶解，其他含有溶液的樣品（如泡菜）則直接用移液器吸取1 mL樣品于干凈的EP管中，用0.85%生理鹽水進行梯度稀釋（10～10），每個梯度做3 次平行實驗。待不同濃度梯度的稀釋液中樣品完全溶解均勻后，按稀釋濃度從低到高的順序各取300 μL稀釋液分別接入MRS固體培養(yǎng)基中，并用無菌涂布器均勻涂開。待其吸收后放置到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行厭氧培養(yǎng)，時間為2 d。取培養(yǎng)后平板上的單一菌落進行劃線分離，一般重復此分離純化步驟2～3 次，即可獲得形態(tài)一致的純化單一菌落。

1.3.1.2 乳酸菌株的復篩

挑取上一步具有典型乳酸菌細胞形態(tài)的單菌落進行革蘭氏染色實驗，并在光學顯微鏡的油鏡下觀察其顏色變化及形態(tài)特征，進一步判斷是否為乳酸菌株（乳酸菌均為革蘭氏陽性菌株）。

1.3.2 乳酸菌株的鑒定

1.3.2.1 細菌基因組DNA提取

將保藏菌株分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在厭氧環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)18 h得到菌液。對其中的細菌按試劑盒法進行DNA的提取。之后每個樣品取2 μL用超微量分光光度計NanoDrop1000測定濃度，測定后將DNA保存在4 ℃，以備后用。

1.3.2.2 PCR擴增及16S rDNA測序

PCR擴增模板及引物依次為實驗獲得乳酸菌基因組DNA及通用引物模板，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 List of primers used in this study

配制總體積為50 μL的PCR擴增體系。分別加入25 μL DreamGreen Mix、各0.5μL的引物27F和1492R、2 μL的DNA模板和22 μL ddHO。每個片段按上述體系擴增兩管。PCR結(jié)束之后，將最終得到的PCR擴增產(chǎn)物送至天一輝遠（廣州）基因科技有限公司進行測序，通過測定16S rDNA的序列進行菌種鑒定。測序完成后將獲得的序列結(jié)果在NCBI進行BLAST比對，從而確定菌株種屬。

1.3.3 乳酸菌株對核苷體外同化能力的評價

1.3.3.1 核苷標準曲線的制作

采用HPLC系統(tǒng)同時檢測肌苷和鳥苷。將33.7 mg肌苷和35.7 mg鳥苷溶解在100 mL 100 mmol/L KPO溶液（以HPO調(diào)至pH 7.0）中制成肌苷-鳥苷溶液。0.22 μm水系濾膜過濾后，將5、8、11、14、17 μL和20 μL肌苷-鳥苷溶液分別注入配有紫外波長檢測器和色譜柱的HPLC裝置。流速1 mL/min，設(shè)定時間40 min。在254 nm波長處測定肌苷和鳥苷的含量，并用標準曲線插值法進行定量。

1.3.3.2 乳酸菌株對核苷降解能力的測定

為了評價乳酸菌株對肌苷和鳥苷的降解能力，將保藏菌株按照3%的量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下活化2 代進行后續(xù)實驗。之后取乳酸菌培養(yǎng)液2 mL，4 ℃、6 000 r/min離心10 min。然后用1 mL 0.85% NaCl溶液洗滌2 次，調(diào)整菌懸液濃度為1×10CFU/mL。再用750 μL肌苷-鳥苷溶液懸浮，37 ℃、120 r/min孵育60 min。之后將溶液4 000×、4 ℃離心10 min。取上清液270 μL。在上清液中加入30 μL 0.1 mol/L HClO溶液，充分混合以防止進一步降解。過濾后將20 μL的混合物注入HPLC裝置，設(shè)定時間40 min。按上述得到的核苷標準曲線計算剩余肌苷和鳥苷含量。根據(jù)下式計算不同菌株對肌苷或鳥苷的降解速率和降解率：

式中：為降解速率/（g/（L·min））；為肌苷或鳥苷殘留量/（g/L）；為肌苷或鳥苷質(zhì)量濃度/（g/L）；為核苷降解率/%。

1.3.4 胞內(nèi)物和胞外物對肌苷和鳥苷的降解作用

為了闡明核苷被降解的物質(zhì)基礎(chǔ)，對菌株的胞外分泌物和胞內(nèi)物進行了提取，并通過上述方法測定它們對肌苷和鳥苷的降解情況。將乳酸菌株以3%的接種量到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下進行2 次傳代培養(yǎng)，取2 mL培養(yǎng)液4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀。1 mL生理鹽水洗滌菌體3 次，收集實驗菌體并調(diào)整菌體濃度為1×10CFU/mL。懸浮于1 mL肌苷-鳥苷緩沖液，37 ℃放置8 h后4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液（胞外分泌物）與450 μL肌苷-鳥苷緩沖液，37 ℃培養(yǎng)60 min后加入100 μL終止劑高氯酸，取20 μL混合液經(jīng)過無菌濾膜過濾用于HPLC分析。菌體沉淀重懸于1 mL生理鹽水，超聲波破碎（200 W，工作時間5 s，停頓5 s）5 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液（胞內(nèi)物）與450 μL肌苷-鳥苷緩沖液混合，37 ℃培養(yǎng)60 min后加入100 μL終止劑高氯酸，0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL混合液用于HPLC分析。

1.3.5 高效降解核苷菌株對黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評價

對黃嘌呤氧化酶的抑制能力評價方法參考Umamahesari等方法并稍作改動。取0.75 mL黃嘌呤底物溶液，0.75 mL提取液混勻，最后加入0.5 mL預先在25 ℃保溫20 min的黃嘌呤氧化酶液（0.5 U/mL）啟動反應(yīng)，在波長295 nm的紫外條件下記錄反應(yīng)時間內(nèi)（0～42 min，每隔6 min記錄一次實驗數(shù)據(jù)）的吸光度變化。對照樣中把黃嘌呤氧化酶液用PBS替換。黃嘌呤氧化酶的活性用黃嘌呤氧化酶的抑制率表達。由于黃嘌呤在295 nm波長處有吸光度，所以需扣除不加樣品和酶的吸光度。每個樣品做3 次平行實驗。用酶標儀檢測波長為295 nm的反應(yīng)液。以別嘌呤醇為陽性對照，黃嘌呤氧化酶抑制率按式（3）計算：

式中：為含有黃嘌呤氧化酶不含樣品的吸光度；為不含黃嘌呤氧化酶和樣品的吸光度；為含有黃嘌呤氧化酶和樣品的吸光度；為含有樣品但不含黃嘌呤氧化酶的吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌株的分離篩選

用無菌的生理鹽水溶液對不同的特色食源性物質(zhì)進行梯度稀釋，每個稀釋度做3 次平行實驗，隨后取稀釋樣品300 μL在MRS固體培養(yǎng)基上涂板后進行擴增培養(yǎng)。經(jīng)過多次分離純化后，最終篩選得到22 株疑似乳酸菌株，其在MRS平板上的菌落形態(tài)如圖1所示。大多數(shù)菌株中間凸起呈半透明，表面上是光滑的點狀菌落，邊緣規(guī)則且無褶皺；另外少部分菌落表面相對暗淡粗糙，中間斑點呈乳黃色，邊緣不規(guī)則。

圖1 乳酸菌菌落形態(tài)鑒定Fig.1 Colony morphology of lactic acid bacterial strains

進一步的鏡檢結(jié)果如圖2所示，收集得到的22 株菌在革蘭氏染色試劑的作用下均呈紫藍色，表明為革蘭氏陽性菌。鏡檢視野內(nèi)菌落形態(tài)均一，在細胞形態(tài)上分別呈現(xiàn)為桿狀（有長有短）、圓狀（橢圓狀），排列形態(tài)為單個排列或呈鏈條狀排列。結(jié)合菌落平板形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，初步判斷為乳酸菌。

圖2 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Gram staining microscopic examination of strains

2.2 乳酸菌株的鑒定

以細菌基因組總DNA為模板，對收集到的22 株乳酸菌株的16S rDNA進行PCR擴增，最終獲得1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物，送至天一輝遠（廣州）基因科技有限公司進行測序。將得到的各菌株16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，以確定菌株類型和種屬關(guān)系，進而對菌種間、菌屬間的差異性予以判斷，實現(xiàn)細菌分類。BLAST的比對結(jié)果如表2所示。

表2 乳酸菌鑒定結(jié)果比對Table 2 Comparison of results of lactic acid bacterial identification

至此，本實驗中分離得到的22 株乳酸菌株可分類為：8 株鼠李糖乳桿菌（）、2 株干酪乳桿菌（）、2 株瑞士乳桿菌（）、2 株植物乳桿菌（）、1 株嗜酸乳桿菌（）、1 株嗜熱鏈球菌（）、1 株活動乳桿菌（）、1 株布氏乳桿菌（）、1 株短乳桿菌（）、1 株戊糖乳桿菌（）、1 株戊糖乳球菌（）、1 株解淀粉乳酸桿菌（）。

2.3 酸菌株對核苷體外同化能力的評價

通過實驗結(jié)果可知，肌苷在本色譜條件下保留時間為24.379 min，鳥苷保留時間為35.105 min。標準曲線分別為=45 571＋14.802（=1）、=47 022－122.09（=0.999 8）。其中為峰面積，為質(zhì)量濃度（g/L）。

乳酸菌對肌苷和鳥苷的體外同化能力實驗結(jié)果如表3、4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 株供試乳酸菌均具有一定的核苷分解能力。但大部分供試菌株對肌苷與鳥苷降解速率均小于2×10g/（L·min）。效果最好的菌株為LB1lac20，對肌苷的降解速率為0.004 6 g/（L·min），降解率為91.19%；對鳥苷的降解速率為0.004 8 g/（L·min），降解率為89.67%。與本實驗其他菌株相比，對肌苷和鳥苷的降解能力顯著。同時可以發(fā)現(xiàn)，菌株對肌苷和鳥苷同化能力之間存在很強的正相關(guān)關(guān)系，可能是由于鳥苷和肌苷屬于同一類物質(zhì)，可由同一酶催化降解。這表明在所測試的菌株中可能存在核苷水解酶。本實驗結(jié)果與Tsuboi等的研究結(jié)論基本一致。在具體菌株對核苷的分解速率上，本實驗篩選出的優(yōu)選菌株LB1lac20遠超楊殿斌等篩選出的其他菌株，僅次于植物乳桿菌DM9218。考慮到反應(yīng)條件及菌種類型的不同，本研究篩選得到的LB1lac20依舊具有很高的研究價值。與麻菊美等的研究結(jié)果相比，LB1lac20對肌苷的降解率高于其篩選出的最高效菌株5-1，但鳥苷的降解率低于此菌株（89.37%）。

表3 不同乳酸菌對肌苷的體外降解情況Table 3 In vitro degradation rates of inosine by different lactic acid bacteria

表4 不同乳酸菌對鳥苷的體外降解情況Table 4 In vitro degradation rates of guanosine by different lactic acid bacteria

此外，作為泡菜來源的LB1lac20，具有價格低廉、無藥物毒副作用等優(yōu)勢，雖然效果不及合成藥物，但是具有安全性和高效性并存的特點，并且可以作為日常飲食參與，患者依從度高。而泡菜是蔬菜利用乳酸菌發(fā)酵而成的低鹽發(fā)酵食品，因其獨特的生化特點、營養(yǎng)和感官特性也被大眾廣泛接受。而已有研究表明，泡菜具有抗氧化，抑菌，抗動脈粥樣硬化等功效，開發(fā)具有益生功能的乳酸菌制劑也是當前泡菜中乳酸菌的一大研究趨勢。綜合考慮菌株對肌苷及鳥苷的分解率及其天然優(yōu)勢，選擇分解兩種核苷速率均為最佳的菌株LB1lac20作為候選菌株進行下一階段實驗。

2.4 胞內(nèi)物和胞外物對肌苷和鳥苷的降解作用

對比不加LB1lac20的對照組（圖3A），本實驗菌株LB1lac20胞外物（圖3C）不能起到降解作用，而胞內(nèi)物（圖3D）在60 min的反應(yīng)時間內(nèi)對核苷有明顯的降解作用，對肌苷和鳥苷的降解率分別可以達到55.87%和32.26%。此實驗結(jié)果說明本實驗菌株LB1lac20的胞外產(chǎn)物不能降解肌苷和鳥苷，甚至一些生命活動不需要的肌苷和鳥苷會被排出胞外，造成肌苷和鳥苷的含量增加。而胞內(nèi)提取物可以起到降解肌苷和鳥苷的作用，但效果會低于同等時間內(nèi)菌懸液（圖3B）的降解率。本實驗的結(jié)果明確顯示乳酸菌對核苷酸與核苷的降解作用是胞內(nèi)完成，這也與金方等得出的結(jié)論一致。此外，之前有研究表明，DM9505可以通過其編碼的肌苷水解酶，降解果糖代謝中間產(chǎn)物肌苷和間接對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)等多種機制共同作用減少尿酸的生成，本實驗結(jié)果進一步證實可能是胞內(nèi)的核苷水解酶系在發(fā)揮作用。核苷水解酶破壞核苷的糖苷鍵，釋放含氮堿和戊糖。核苷攝取是嘌呤和嘧啶進入腸上皮細胞的主要途徑，某些乳酸菌可以通過降解或者吸收核苷競爭性減少腸道上皮對核苷的吸收，從而減少尿酸的生成。這些核苷酶廣泛存在于植物和微生物中，但尚未在哺乳動物中檢測到。

圖3 LB1lac20對肌苷和鳥苷的降解Fig.3 Chromatograms showing LB1lac20 degradation of inosine and guanosine

2.5 高效降解核苷菌株對黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評價

為評價LB1lac20作為黃嘌呤氧化酶抑制劑的能力，利用尿酸生成法建立體外篩選模型。在反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤底物生成尿酸和超氧陰離子，而尿酸在295 nm紫外條件下有特征吸收峰，利用紫外分光光度法通過測定一定時間內(nèi)吸光度的變化，即尿酸生成量，衡量黃嘌呤氧化酶的活性變化。同時使用別嘌呤醇作為本實驗的陽性對照。別嘌呤醇主要通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性進而達到抑制尿酸生成的目的，它可以和黃嘌呤氧化酶的活性中心結(jié)合生成別嘌呤二醇（又稱氧嘌呤醇），別嘌呤二醇和黃嘌呤氧化酶結(jié)合形成不具有催化作用的復合體，即達到了抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用。LB1lac20作為黃嘌呤氧化酶抑制劑的效果如圖4所示。

圖4 黃嘌呤氧化酶體外抑制能力的評價結(jié)果Fig.4 In vitro xanthine oxidase-inhibitory capacity of LB1lac20

當黃嘌呤氧化酶濃度為0.5 U/mL時，比較其在不同反應(yīng)時間（6～42 min）下的抑制能力。結(jié)果表明，在12 min別嘌呤醇（0.2 mg/mL）最先對黃嘌呤氧化酶起到抑制作用，對黃嘌呤氧化酶的敏感度高于LB1lac20菌懸液、胞內(nèi)物和胞外物。在18 min活菌懸液和其胞內(nèi)提取物也開始黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生抑制作用。胞外分泌物在24 min開始對黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生了微弱的抑制作用。在12～42 min的反應(yīng)時間內(nèi)，別嘌呤醇、活菌懸液、胞內(nèi)提取物和胞外分泌物的抑制率均隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增加，之后則基本達到平穩(wěn)狀態(tài)。最終當反應(yīng)時間達到42 min，別嘌呤醇（0.2 mg/mL）、活菌懸液、胞內(nèi)提取物和胞外分泌物最終對黃嘌呤氧化酶的抑制率分別達66.61%、21.27%、19.60%和3.90%。結(jié)果表明此菌株的活菌懸液和胞內(nèi)提取物顯示出良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，進一步證實此菌株具有很大的降尿酸潛力。此外，LB1lac20菌懸液及其胞內(nèi)提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制能力較為接近，并且遠高過其胞外分泌物，其黃嘌呤抑制能力可能主要來源于胞內(nèi)?？傊?，通過建立尿酸生成法建立體外篩選模型，LB1lac20被證明具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制能力，未來可以作為黃嘌呤氧化酶抑制劑參入到日常飲食中，并用于高尿酸血癥的預防和治療，具有很大的應(yīng)用前景和價值。

3 結(jié)論

高尿酸血癥是目前危害人類健康最為常見的代謝綜合征之一，治療關(guān)鍵為降低血尿酸濃度。降解核苷是乳酸菌降低尿酸含量的主要方式，本研究也選用相同原理篩選具有潛在降尿酸能力的菌株。此外，黃嘌呤氧化酶是嘌呤分解代謝過程中的一種關(guān)鍵性的酶，它可以催化次黃嘌呤和黃嘌呤直接生成尿酸。因此當體內(nèi)黃嘌呤氧化酶活性異?；钴S時，則會導致大量尿酸的生成，從而引發(fā)高尿酸血癥。因而，黃嘌呤氧化酶抑制劑也是當前研究降尿酸藥物的一個重要靶點。

本實驗以國內(nèi)外特色食源性物質(zhì)為來源，利用常規(guī)的菌種分離方法（梯度稀釋法、涂布培養(yǎng)法等）和現(xiàn)代的分子生物學方法（16S rDNA序列比對法）分離鑒定乳酸菌株。然后借助HPLC法分別鑒定了20 株收集得到的乳酸菌株其體外降解肌苷和鳥苷的能力，成功篩選出1 株具有高效體外降核苷活性的優(yōu)勢菌株LB1lac20。此菌種分離自國產(chǎn)泡菜，對肌苷和鳥苷的降解率均達到90%以上，是一株很有潛力的降尿酸乳酸菌株。因此本實驗選擇LB1lac20作為后續(xù)研究菌株。在此基礎(chǔ)上對該菌株的胞內(nèi)物和胞外物進行提取，并再次借助HPLC法對其胞內(nèi)物和胞外物對肌苷和鳥苷的降解能力進行評價。證實其高效的核苷降解能力主要是由于胞內(nèi)物的作用產(chǎn)生。為了進一步分析菌株LB1lac20的潛在降尿酸作用，利用尿酸生成法對尿酸生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶（黃嘌呤氧化酶）進行體外抑制能力測定，并用臨床藥物別嘌呤醇作為陽性對照，分析菌株LB1lac20對黃嘌呤氧化酶的抑制作用效果。結(jié)果表明此菌株的菌懸液和胞內(nèi)提取物均具有良好的黃嘌呤氧化酶抑制能力。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的LB1lac20是1 株很有潛力的降尿酸乳酸菌株，未來可參與到高尿酸血癥的預防和治療中，具有很大的應(yīng)用價值。后續(xù)可以進一步研究其在細胞和動物實驗中的功效，以得到更直接準確地調(diào)控尿酸能力。