張敏，李興瓊，晏四斤，李臘梅，杜瑤，曾慶盈，潘利鋒，龔睿

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 永川 402160；2.重慶市永川區(qū)中醫(yī)院推拿科，重慶 永川 402160

脫髓鞘病變是脊髓壓迫性損傷（compressedspinal cord injury，CSCI）的重要病理改變之一[1,2]。神經(jīng)纖維脫髓鞘可引起神經(jīng)沖動(dòng)在傳導(dǎo)中發(fā)生擴(kuò)散，阻礙軸索電傳導(dǎo)，從而引起損傷平面以下運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及括約肌功能部分或/和全部障礙。大量的基礎(chǔ)研究和臨床觀察顯示，CSCI 后喪失的神經(jīng)功能有某種程度的恢復(fù)，然而其機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入對(duì)CSCI 后神經(jīng)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的研究，對(duì)于治療策略的制定和藥物的研發(fā)具有重要的意義。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，簡(jiǎn)稱EGFR、erbB1 或者HER-1），其分子量為170 kDa，由一個(gè)跨膜疏水區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。資料顯示，活化型表皮生長(zhǎng)因子受體（phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，并抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，提示EGFR 活化可能對(duì)髓鞘有保護(hù)作用。然而目前尚無(wú)pEGFR 在CSCI 后神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中的作用及其相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠CSCI 模型，觀察CSCI 后pEGFR 蛋白的表達(dá)變化并分析其與CSCI 后大鼠后肢神經(jīng)功能恢復(fù)之間的關(guān)系，初步探討pEGFR 對(duì)CSCI 后大鼠后肢神經(jīng)功能的影響，同時(shí)探討上述影響產(chǎn)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康雌性SD 大鼠120 只，體質(zhì)量200～230 g，SPF 級(jí)，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將動(dòng)物均分為6 組：正常組（normal group，N），模型1 d 組（model 1 day group，D1），模型7 d 組（model 7 days group，D7），模型14 d 組（model 14 days group，D14）、模 型21 d 組（model 21 days group，D21）和PD153035 組（PD153035 group）。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠phosphor-EGFR 一抗（Abcam，ab15669），兔抗大鼠Caspase-3 一抗（Abcam，ab44976）；小鼠抗大鼠，NG2 一抗（Abcam，ab83508），山羊抗小鼠熒光二抗（TRITC）（北京中杉公司），驢抗兔熒光二抗（碧云天公司）；pEGFR 抑制劑（Abcam，ab141839）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作（1）對(duì)正常組的處理。以3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔注射麻醉大鼠，持續(xù)面罩給氧，逐層顯露第11 胸椎到第3 腰椎椎弓，去除第1 腰椎椎板及其前后關(guān)節(jié)突，取出脊髓進(jìn)行研究。（2）用梁益建等[3]設(shè)計(jì)的大鼠脊髓壓迫器制備模型組。3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔注射麻醉大鼠，持續(xù)面罩給氧，逐層顯露第11 胸椎到第3 腰椎椎弓，去除第1 腰椎椎板及其前后關(guān)節(jié)突，將一鋼板固定于第12 胸椎和第2 腰椎之間，置一壓迫鋼板于第1 腰椎對(duì)應(yīng)脊髓表面。從固定鋼板中央小孔旋入一螺絲釘，直至前端與壓迫鋼板接觸，然后逐層縫合傷口。待麻醉蘇醒后，大鼠后肢及大小便功能完全正常，顯示無(wú)脊髓損傷。從術(shù)后第1 d 開(kāi)始，在局麻下將螺釘擰入1/4 圈（0.25 mm），以后每隔2～3 d 擰1 次（每次0.25 mm），直至雙下肢完全癱瘓（約20 d），視為造模成功。然后行脊髓解壓術(shù)，并分別于解壓后1 d，7 d，14 d 和21 d 取出脊髓進(jìn)行研究。（3）PD153035 組的處理。造模成功后立即腹腔注射0.6 mg/kg PD153035，以后每24 h 重復(fù)注射1 次，14 d 后取出脊髓進(jìn)行研究。

1.2.2 Basso Beattie Bresnahan（BBB）評(píng)分 分別于脊髓解壓術(shù)后1，7，14 和21 d 用Basso Beattie Bresnahan（BBB）評(píng)分法[4]進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定。主要依據(jù)大鼠后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、關(guān)節(jié)活動(dòng)和軀干位置等進(jìn)行評(píng)分。后肢全癱為0 分，完全正常為21 分。

1.2.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)pEGFR-NG2+、activecaspase-3-NG2+細(xì)胞 在脊髓解壓術(shù)后1 d，7 d，14 d和21 d，每組選擇5 只大鼠。麻醉動(dòng)物后，開(kāi)胸暴露心，經(jīng)左心室，主動(dòng)脈插管，并剪開(kāi)右心耳，用微量泵灌注4 ℃生理鹽水200 mL，待流出液清亮后，灌注40 g/L 多聚甲醛500 mL 灌注固定，然后取出以傷段脊髓為中心，長(zhǎng)約2 cm 的脊髓，30%蔗糖脫水過(guò)夜（4 ℃）；待脫水完全后，用恒冷冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，片厚10 μm，備用。將不同時(shí)間點(diǎn)的冰凍組織切片在0.01 mol/L PBS 緩沖液沖洗10 min×3 次，用驢血清37 ℃水浴箱封閉1 h。分別滴加兔和小鼠來(lái)源的一抗EGFR、Caspase-3 和NG2，覆蓋標(biāo)本，切片置于濕盒，4 ℃冰箱孵育24 h。0.01 mol/L PBS 緩沖液沖洗10 min × 3 次。滴加驢抗兔、抗小鼠的熒光二抗，37 ℃水浴箱孵育1.5 h。0.01 mol/L PBS 沖洗10 min×3 次。加DAPI 染核，室溫5 min，0.01 mol/L PBS 沖洗10 min × 3 次，甘油封片。用共聚焦顯微鏡觀察并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每時(shí)間點(diǎn)5 張切片，由2 名非本課題組且熟悉免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)人員，對(duì)所有pEGFR，activecaspase-3 與NG2 共雙標(biāo)的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.4 Western blotting 檢測(cè)pEGFR、Caspase-3 蛋白表達(dá)變化 每組動(dòng)物5 只，模型制作成功后麻醉，4 ℃生理鹽水快速灌注后，冰上快速取出脊髓組織，放入裝有細(xì)胞裂解液的勻漿器中提取蛋白，12000 r/min 離心10 min，吸上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。煮變性后按照蛋白定量結(jié)果進(jìn)行加樣。經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉，室溫反應(yīng)2 h。PBST洗膜后分別加入EGFR 抗體和Caspase-3 抗體孵育，4 ℃過(guò)夜。PBST 洗膜后加入相應(yīng)二抗，室溫反應(yīng)2 h。PBST 洗膜，ECL 顯色。

2 結(jié)果

2.1 BBB 評(píng)分

經(jīng)單因素方差分析（one-way ANOVA），BBB 評(píng)分顯示，CSCI 解壓后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能隨時(shí)間延長(zhǎng)而有所改善；PD153035 組大鼠后肢功能雖有一定程度的改善，但其BBB 評(píng)分明顯低于模型14 d 組，模型14 d 組、21 d 組分別與模型1 d 組比較，PD153035 組與模型14 d 組比較，均P＜0.05，見(jiàn)圖1。

2.2 pEGFR-NG2+、active-caspase-3-NG2+細(xì)胞熒光雙標(biāo)

pEGFR-NG2+、active-caspase-3-NG2+細(xì)胞散在分布于正常組白質(zhì)中（圖2、3）。CSCI 解壓后，pEGFRNG2+細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多并于解壓后第14 d 達(dá)到高峰；PD153035 組中pEGFR-NG2+細(xì)胞明顯減少（模型14 d 組分別與正常組、模型1 d 組比較，PD153035 組與模型14 d 組比較，均P＜0.05）。activecaspase-3-NG2+細(xì)胞于解壓后即達(dá)到最高峰并隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少；PD153035 組中active-caspase-3-NG2+細(xì)胞未見(jiàn)明顯減少（模型1 d 組分別與正常組、模型14 d 組比較，PD153035 組與模型1 d 組比較，均P＜0.05）。

2.3 Western blotting 檢測(cè)pEGFR、total-caspase-3 和active-caspase-3 表達(dá)

正常組及模型1 d，7 d，14 d 和21 d 組的樣本在特定位置均出現(xiàn)特異的免疫反應(yīng)條帶。正常組、模型1 d 組pEGFR 蛋白表達(dá)水平低，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型7 d，14 d 組pEGFR 蛋白表達(dá)量逐漸增高，至14 d 達(dá)到峰值，較第1 d 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（D14 組分別與D1，D7，D21 組比較，P＜0.05）；注射PD153035 后，pEGFR 的表達(dá)明顯較模型14 d 組降低（PD153035 組與D14 組比較，P＜0.05），見(jiàn)圖4。CSCI 解壓后，total-caspase-3、active-caspase-3 的表達(dá)明顯增高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸降低（D14 組與D1 組比較，P＜0.05）；然而注射PD153035 后，total-caspase-3、active-caspase-3 的表達(dá)未見(jiàn)明顯降低（PD153035 組與D1 組比較，P＜0.05；PD153035 組與D14 組比較，P＞0.05），見(jiàn)圖5。

3 討論

pEGFR 是近年來(lái)備受關(guān)注的一類促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成（oligodendrogenesis）的蛋白受體，其可激活下游信號(hào)分子以調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖、遷移、分化，抑制細(xì)胞凋亡。然而，pEGFR 在脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中的作用尚存在爭(zhēng)議。Erschbamer等[5]報(bào)道，EGFR 抑制劑可以促進(jìn)脊髓損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和膀胱功能的恢復(fù)。Li 等[6]亦報(bào)道，EGFR抑制劑表達(dá)可以減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生，同時(shí)可以改善局部微環(huán)境、促進(jìn)成年大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而，Sharp 等[7]未能重復(fù)Erschbamer 等[4]的實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脊髓壓迫性損傷后使用EGFR 受體抑制劑并不能提高大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能，反而降低了其運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)能力。本研究顯示：CSCI 解壓后，pEGFR、pEGFR-NG2+細(xì)胞表達(dá)變化的規(guī)律與CSCI解壓后BBB 評(píng)分的變化規(guī)律基本一致；然而腹腔注射pEGFR 特異性抑制劑PD153035，大鼠BBB 評(píng)分明顯降低，提示pEGFR 高表達(dá)可促進(jìn)CSCI 解壓后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。這一結(jié)果同Sharp 等[7]的研究基本一致，然而同Erschbamer 等[5]的研究結(jié)果相異。出現(xiàn)這些差異可能與以下因素有關(guān)：脊髓損傷平面不同，本實(shí)驗(yàn)大鼠損傷部位位于腰段脊髓，而以上實(shí)驗(yàn)大鼠的損傷部位均位于胸段脊髓；各實(shí)驗(yàn)中使用的EGFR抑制劑不同，由于EGFR 抑制劑的不同，Sharp 等[7]亦未能重復(fù)Erschbamer 等[5]的實(shí)驗(yàn)。

Caspase-3 是最重要的凋亡蛋白酶之一，通常位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡通路下游，其表達(dá)量直接反映細(xì)胞凋亡程度。在正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3 以無(wú)活性的酶原形式存在，細(xì)胞凋亡信號(hào)的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3 發(fā)生裂解并被激活，活化后的Caspase-3 可以通過(guò)線粒體途徑[4,8]、死亡受體途徑[9,10]和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）介導(dǎo)的顆粒酶B 途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為闡明pEGFR 高表達(dá)促進(jìn)CSCI 解壓后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察CSCI 解壓后total-caspase-3、active-caspase-3 的表達(dá)變化，并分析total-caspase-3、active-caspase-3 表達(dá)變化與pEGFR 表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：CSCI 解壓術(shù)后，total-caspase-3、active-caspase-3 隨即達(dá)到高峰并隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，并于術(shù)后21 d 回落至接近正常組水平，即pEGFR 低表達(dá)時(shí)total-caspase-3、activecaspase-3 呈現(xiàn)高表達(dá)，而pEGFR 高表達(dá)時(shí)totalcaspase-3、active-caspase-3 呈現(xiàn)低表達(dá)，這一結(jié)果提示CSCI 后pEGFR 和total-caspase-3、active-caspase-3 的表達(dá)可能呈現(xiàn)一種負(fù)相關(guān)的關(guān)系。為證實(shí)這一假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)觀察腹腔注射PD153035 后total-caspase-3、activecaspase-3 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，腹腔注射PD153035后，total-caspase-3、active-caspase-3 呈高表達(dá)。

綜上所述，CSCI 后pEGFR 高表達(dá)可能對(duì)脊髓組織產(chǎn)生保護(hù)作用、促進(jìn)大鼠后肢神經(jīng)功能的恢復(fù)，而這一作用可能是通過(guò)抑制total-caspase-3、active-caspase-3的表達(dá)以減少少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。