黃麗萍，李思鴻，鐘啟文,3*，王晉民

( 1.青海大學(xué)，青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；3.青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

香瓜茄(Solanummuricatum)原產(chǎn)于南美洲，屬茄科茄屬香瓜茄種，為多年生雙子葉草本植物。其果實(shí)成熟后呈淡黃色并帶有紫色或紫紅色條紋，鮮嫩多汁，風(fēng)味獨(dú)特，口感清甜且熱量低，富含多種礦物質(zhì)和維生素[1],枝干造型獨(dú)特，具有欣賞價(jià)值，因而近年來逐漸受到人們的喜愛。當(dāng)前對(duì)香瓜茄的研究主要集中于園藝學(xué)性狀、化學(xué)成分分析、栽培、貯藏等傳統(tǒng)農(nóng)學(xué)研究和功能性研究，隨著香瓜茄市場(chǎng)規(guī)模愈加壯大，利用基因表達(dá)分析鑒定與香瓜茄種質(zhì)資源、風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的關(guān)鍵物質(zhì)的調(diào)控基因，成為研究人員開展品質(zhì)育種工作研究的重要方向[2]。qRT-PCR技術(shù)是研究基因表達(dá)的重要技術(shù)手段，主要應(yīng)用于檢測(cè)不同細(xì)胞類型和組織的mRNA表達(dá)水平,也能精確檢測(cè)相關(guān)基因在各種情況下的表達(dá)豐度，如植物生長(zhǎng)形成、品質(zhì)、產(chǎn)量等相關(guān)基因表達(dá)，這些研究均離不開穩(wěn)定的內(nèi)參基因[3-4]。

目前，已有學(xué)者成功鑒定出多個(gè)物種不同條件下的內(nèi)參基因，同時(shí)在IGG (http://icg.big.ac.cn)中已經(jīng)收錄了超過150種植物的多種內(nèi)參基因信息[5]。在植物體中常用的內(nèi)參基因包括β-微管蛋白基因(tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitin，UBQ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceral-dehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、肌動(dòng)蛋白基因(actin，ACT)、核糖體RNA基因(如18SrRNA、26SrRNA)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(elongationfactors1alpha，EF1α)等[6]。內(nèi)參基因在各個(gè)組織部位都有表達(dá)，但仍然受到組織部位差異和外界脅迫的影響，呈現(xiàn)不同的表達(dá)穩(wěn)定性，并不存在在任何組織部位和任何條件下都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，如EF1α被認(rèn)為是馬鈴薯在生物(晚疫病)和非生物脅迫(鹽脅迫)下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而EF1α和APRT則是冷脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[7]。所以需要尋找特定條件下表達(dá)變化最小的內(nèi)參基因，以盡可能地反映靶基因真實(shí)的轉(zhuǎn)錄水平，或選擇多個(gè)內(nèi)參基因組合的方式來提高內(nèi)參基因篩選的可靠性[8]。為了加強(qiáng)對(duì)新興水果香瓜茄的深入研究，本研究以初花期香瓜茄的不同組織部位及病害脅迫下苗期香瓜茄的葉片為試驗(yàn)材料，選取9個(gè)常用內(nèi)參基因GAPDH1、UBI、UK、β-TUB、GAPDH2、EF1α、ACT、APT、18SrRNA，對(duì)比分析它們?cè)谙愎锨阎械谋磉_(dá)水平，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評(píng)估候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性，旨在為香瓜茄的相關(guān)基因分析提供穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院種子繁育的初花期香瓜茄植株，取根(O1)、莖(O2)、葉(O3)和花(O4)等4個(gè)組織部位作為多組織樣品。采集青海西寧地區(qū)含4種病毒(未完全脫毒)的香瓜茄組培苗苗期植株葉片(S1)及含1種病毒的香瓜茄種子繁育實(shí)生苗苗期植株葉片(S2)，甘肅武威地區(qū)出現(xiàn)花斑、卷葉等癥狀的香瓜茄苗期植株葉片(S3)，云南石林地區(qū)出現(xiàn)疫病癥狀的香瓜茄苗期植株葉片(S4)，作為病害脅迫條件下的樣品。采集的樣品先進(jìn)行液氮速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存取用。

1.2 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取樣品總RNA，利用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證總RNA完整性，通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)，NanoDrop Technologies)測(cè)定RNA的純度，通過Fast-King cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(中國(guó)，生工生物工程(上海)股份有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，對(duì)總RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)總量需調(diào)配至100 ng。

1.3 候選內(nèi)參基因及qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

在IGG中選取近緣茄科作物的9個(gè)內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，運(yùn)用Primer Premier6設(shè)計(jì)引物，得到9個(gè)候選內(nèi)參基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因名稱、引物序列及片段擴(kuò)增長(zhǎng)度如表1所示。

表1 候選內(nèi)參基因qRT-PCR引物序列

1.4 qRT-PCR反應(yīng)及分析

取1.2中的cDNA樣品(cDNA樣品稀釋至10-1)為模板，以表1中的引物序列為引物，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用Roche LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，按照SYBR Green法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，熒光定量染料選用Premix Ex Taq(TaKaRa)。反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL模板，各0.6 μL的正向及反向引物(10 μmol/L)，10 μL 2X SanTaq PCR Mix預(yù)混液及7.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。58 ℃至95 ℃范圍內(nèi)連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度獲得熔解曲線，用于評(píng)估引物特異性；每個(gè)樣品內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Cq，分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

運(yùn)用geNorm、NormFinder和BestKeeper等3種軟件[9]對(duì)9個(gè)候選內(nèi)參基因在初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。geNorm和NormFinder是基于微軟Excel軟件下的算法。geNorm作為使用最廣泛的軟件，以配對(duì)差異值(V)和M值作為衡量?jī)?nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的主要指標(biāo)，M值越低的基因表達(dá)越穩(wěn)定[10]。通過計(jì)算單個(gè)基因和所有其他被測(cè)對(duì)照基因之間的平均兩兩變異，測(cè)量基因表達(dá)穩(wěn)定性M。使用時(shí)首先需要在微軟Excel軟件中將qRT-PCR所得到的候選內(nèi)參基因Cq值，根據(jù)公式Q = 2Cq(min)-Cq(sample)轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量Q(Cq(min)為各組織樣本和病害脅迫下候選內(nèi)參基因的最小Cq值)；然后將基因相對(duì)表達(dá)量Q數(shù)據(jù)導(dǎo)入geNorm程序，得到候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性折線圖，該圖最左邊基因的M值與基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即M值越小，代表基因的穩(wěn)定值越高，反之則越低。由于本試驗(yàn)中的候選內(nèi)參基因大于3個(gè)，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，在2個(gè)連續(xù)的歸一化因子(NFn和NFn+1)之間計(jì)算Vn/n+1(其中n為基因表達(dá)歸一化的內(nèi)參基因的數(shù)量)，配對(duì)差異值(V)以0.15為界限，大于臨界值需要引入該內(nèi)參基因?qū)笠晃粌?nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

NormFinder軟件是根據(jù)給定樣本集和試驗(yàn)處理中的多個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，排序等級(jí)最低的為該條件下表達(dá)最穩(wěn)定的基因，即M值越小，表示基因的穩(wěn)定性越高。其數(shù)據(jù)前處理同geNorm軟件一樣，處理后導(dǎo)入的同樣是基因相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)軟件的不同算法得到表達(dá)穩(wěn)定值M，根據(jù)M值進(jìn)行穩(wěn)定性排序。

BestKeeper軟件則是通過比較各候選內(nèi)參基因在不同樣品間Cq值產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、變異系數(shù)(CV)及相關(guān)系數(shù)(r)來確定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。當(dāng)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性越好，內(nèi)參基因一般呈現(xiàn)較高的r值，較小的SD值和CV值。此外，當(dāng)SD值大于1 時(shí)，則表明候選內(nèi)參基因的表達(dá)不穩(wěn)定。較前兩個(gè)軟件其優(yōu)勢(shì)在于，它不單單能夠評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，而且可以對(duì)多種目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行評(píng)估。

最后，通過對(duì)三種軟件分析結(jié)果進(jìn)行比較，從多個(gè)候選基因中篩選出最優(yōu)的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片提取的總RNA，使用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，電泳條帶清晰，28S∶18S條帶接近2∶1。同時(shí)，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，A260/A280 比值均在1.615～2.565，證明RNA完整性良好。對(duì)于本試驗(yàn)中出現(xiàn)的A260/A280≥2，但A260/A230≤1，可能是胍鹽殘留；A260/A280≤2，但A260/A230與A260/A280相比顯著下降，可能是出現(xiàn)了蛋白殘留;1≤A260/A280≤1.5，1≤A260/A230≤1.5，可能是由于酚殘留。綜合考慮凝膠電泳檢測(cè)與NanoDrop 2000檢測(cè)結(jié)果，提取的RNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 香瓜茄不同樣本的總 RNA 質(zhì)量和純度檢測(cè)

2.2 內(nèi)參基因qRT-PCR特異性分析

對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果顯示9個(gè)內(nèi)參基因的熔解曲線只有單一信號(hào)峰出現(xiàn)；再對(duì)內(nèi)參基因引物qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示單一條帶。綜合以上結(jié)果說明9個(gè)內(nèi)參基因引物無二聚體且特異性良好，可以在該qRT-PCR條件下進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 由圖1可知，在8個(gè)不同樣本中，除了葉片(O3)的V2/3=0.154和病毒病感病苗葉片(S3)的V2/3= 0.169，配對(duì)差異值均大于0.15，需要引入第3個(gè)內(nèi)參基因。其余6個(gè)樣本候選內(nèi)參基因的配對(duì)差異值均小于0.15，表明可使用2個(gè)內(nèi)參基因在香瓜茄多組織部位和病害脅迫條件下進(jìn)行qRT-PCR歸一化；由圖2可知，各樣本結(jié)果略有差異，但所有樣本候選內(nèi)參基因的M值均在1.5以下。當(dāng)以香瓜茄不同組織為材料時(shí)，根(O1)中M值最小的為18SrRNA和APT，莖(O2)和花(O4)中M值最小的為GAPDH2和APT，葉(O3)中M值最小的為EF1α和APT；當(dāng)以香瓜茄不同病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片為材料時(shí)，組培苗葉片(S1)、病毒病感病苗葉片(S3)和疫病感病苗葉片(S4)中M值最小的為GAPDH2和APT，實(shí)生苗葉片(S2)中M值最小的為UBI和APT。結(jié)合圖1和圖2分析可知，香瓜茄根部?jī)?nèi)參基因最理想的為18SrRNA和APT；香瓜茄莖和花，組培苗葉片和疫病感病苗葉片內(nèi)參基因最理想的為GAPDH2和APT；組織處理中葉片(V2/3=0.154)及病害脅迫條件下病毒病感病苗葉片(V2/3=0.169)由于V2/3超過0.15，需要引入第3個(gè)基因進(jìn)行矯正，內(nèi)參最適數(shù)目為3個(gè)，均含APT。由以上分析可知，geNorm軟件分析得到不同條件下香瓜茄最適的內(nèi)參基因?yàn)锳PT。

圖1 geNorm軟件分析內(nèi)參基因最適數(shù)目

圖2 候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值

2.3.2 NormFinder分析 由表3可知，9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性在初花期香瓜茄不同組織部位及病害脅迫條件下苗期香瓜茄葉片中排序不同，根、莖、葉和花中表達(dá)穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因?yàn)锳PT，其次是18SrRNA，而GAPDH1基因在根、莖、葉中表達(dá)穩(wěn)定性最差，β-TUB基因在花中表達(dá)最不穩(wěn)定；在病害脅迫處理下，表達(dá)穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因是APT，其次是18SrRNA和UBI，而β-TUB在病毒病感病苗葉片中穩(wěn)定性最差，ACT在組培苗和疫病感病苗葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性最差。該軟件排序穩(wěn)定性分析結(jié)果與geNorm軟件穩(wěn)定性分析結(jié)果基本一致。

表3 NormFinder軟件分析香瓜茄中9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

2.3.3 BestKeeper分析 由表4可知，9個(gè)候選內(nèi)參基因中18SrRNA(SD = 0.767)和UBI(SD = 0.902)，SD值低于1.0，其他內(nèi)參基因的SD值均大于1.0，說明基因18SrRNA和UBI表達(dá)穩(wěn)定性最好。而在9個(gè)候選基因中，GAPDH2基因的SD值最高(SD = 2.127)，表明該基因表達(dá)穩(wěn)定性最差。

表4 BestKeeper軟件分析香瓜茄中9個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

因此，綜合BestKeeper軟件穩(wěn)定性分析結(jié)果與geNorm和NormFinder軟件穩(wěn)定性分析結(jié)果，從9個(gè)不同的候選內(nèi)參基因中，篩選獲得香瓜茄3個(gè)表達(dá)穩(wěn)定性良好的內(nèi)參基因APT、18SrRNA和UBI。

3 討論與結(jié)論

為了篩選香瓜茄的穩(wěn)定內(nèi)參基因，本文分析對(duì)比了香瓜茄在不同組織部位及病害脅迫條件下9個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明：geNorm軟件分析確定的最理想內(nèi)參基因是APT；NormFinder軟件分析確定的穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因?yàn)锳PT，其次是18SrRNA和UBI；BestKeeper軟件分析確定的符合條件的穩(wěn)定內(nèi)參基因?yàn)?8SrRNA和UBI。Tang等[11]用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4種軟件分析了馬鈴薯的穩(wěn)定內(nèi)參基因，在干旱和滲透脅迫條件下EF1α和sec3基因是馬鈴薯中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；但Mariot等[12]用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件在分析馬鈴薯不同塊莖內(nèi)參基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，geNorm和NormFinder軟件確定的穩(wěn)定內(nèi)參基因非常相似，均為C2和sec3基因?yàn)榉€(wěn)定內(nèi)參基因，而BestKeeper軟件分析的結(jié)果與其他2個(gè)軟件不同，確定了第三內(nèi)參基因CUL3A。本文在利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件分析香瓜茄不同組織部位和不同非生物脅迫條件下穩(wěn)定內(nèi)參基因時(shí)出現(xiàn)了與Mariot等[12]研究結(jié)果同樣的情況，篩選到了3個(gè)(APT、18SrRNA和UBI)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，證明不同分析軟件的評(píng)估方法會(huì)影響內(nèi)參基因穩(wěn)定性的最后排名。

內(nèi)參基因的表達(dá)水平在不同物種中不是恒定的，甚至在同一物種不同組織部位表達(dá)也不完全相同。相關(guān)研究表明，茄科中馬鈴薯、番茄、辣椒的穩(wěn)定內(nèi)參基因是不同的[13-15]，如馬鈴薯塊莖中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是C2、sec3和CUL3A[12]； Cheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)UBI基因是辣椒果實(shí)發(fā)育中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在番茄中，DNAJ、GAPDH和TUA基因[12]早就被用作番茄中基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，而Exposito-Rodriguez等[14]在研究番茄發(fā)育過程中的內(nèi)參基因時(shí)，認(rèn)為以CAC和TIP41基因?yàn)閮?nèi)參基因可以可靠地標(biāo)準(zhǔn)化整個(gè)番茄發(fā)育過程中的基因表達(dá)情況。本研究結(jié)果同樣證明內(nèi)參基因在同一物種的不同組織部位及病害脅迫條件下的穩(wěn)定性是不完全相同，如NormFinder軟件分析結(jié)果表明：APT在香瓜茄葉片中的穩(wěn)定表達(dá)值(M)為0.8，花中的穩(wěn)定表達(dá)值為 0.472，而在香瓜茄苗期病毒病感病苗葉片中的穩(wěn)定表達(dá)值為0.525。

綜上可知，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種分析軟件篩選得到APT、18SrRNA和UBI為香瓜茄穩(wěn)定內(nèi)參基因，其中APT在不同組織部位及病害脅迫條件下都有著良好的表達(dá)穩(wěn)定性，最終確定APT基因是本試驗(yàn)條件下定量檢測(cè)香瓜茄基因表達(dá)的最理想內(nèi)參基因。