何麗儀 車志文

親子鑒定是通過對人類遺傳標記的檢測，根據(jù)遺傳規(guī)律分析，對有爭議的親子關系進行親緣關系鑒定。[1]隨著科技的日新月異，親子鑒定已經(jīng)成為了我們日常生活中常見的活動，如辦理出生證明、報戶口、公正、訴訟、尸源認定等，都與親子鑒定有聯(lián)系?！吨腥A人民共和國民法典》的頒布并于2021年1月1日起施行，直接規(guī)范了此類確認和否認親子關系的訴訟，強化了父母與子女之間的權利與義務。通過司法鑒定明確是否存在親子關系，已成為現(xiàn)實社會中許多解決涉及撫養(yǎng)、贍養(yǎng)和繼承等訴訟案件的關鍵，因此一個客觀、科學的鑒定結論十分重要。目前，國內外的親子鑒定案例中，多數(shù)都采用STR基因座分型方法；但在此過程中偶爾會遇到個別基因座不相符合的情況，其原因有多種，等位基因丟失是其中之一。等位基因丟失的現(xiàn)象表現(xiàn)為在相應基因座上僅檢測出1個等位基因，與純合子的檢測結果相似，但峰面積和峰高卻與雜合子相當。[2]近年來，關于常染色體STR基因座的等位基因丟失現(xiàn)象常有文獻報道，而且對多個基因座均有報道，可見此現(xiàn)象在日常的親權鑒定中常有發(fā)生。本文擬分析兩個案例，以探討等位基因的丟失及其對親權鑒定的影響。

一、案例資料

（一）案例資料與方法

1.案情摘要。

案例一：因入戶需要，對疑父、孩子生母和孩子進行親權鑒定。分別采集三人的指端末梢血涂于已滅菌的濾紙片上晾干保存、備檢。

案例二：因辦理出生醫(yī)學證明需要，對疑父、孩子生母和孩子進行親權鑒定。分別采集三人的指端末梢血涂于已滅菌的濾紙片上晾干保存、備檢。

2.實驗過程。

（1）DNA提取：分別剪取少量的上述血樣于PE管中，用純水洗脫血紅素后加入濃度為5%的Chel?ex-100，經(jīng)過56℃孵育，98℃變性，提取血樣DNA備用。

（2）PCR擴增：

案例一采用ABI 9700擴增儀，STRtyper-21G和PowerPlex 21五色熒光標記復合擴增系統(tǒng)，10μl體系（8μ l擴增混合液+2μ lDNA模板）進行擴增。

案例二采用ABI 9700擴增儀，STRtyper-21G和PowerPlex 21五色熒光標記復合擴增系統(tǒng)用10μl體系（8μ l擴增混合液+2μ lDNA模板）進行擴增;Mi?croreaderTM21 Direct ID System和MicroreaderTM23sp ID System五色熒光標記復合擴增系統(tǒng)用10μl體系（9μ l擴增混合液+1μ lDNA模板）進行復測擴增。

（二）檢測方法

STR基因座檢測：分別將各個樣本的1μl PCR擴增產(chǎn)物加入裝有含內標的HiDiTM溶液（內標與HiDiTM溶液的比例為1:10）的96孔板上，并在3130XL型基因分析儀（美國ABI公司）上進行毛細管電泳，用GeneMapper ID v 3.2軟件分析各基因座的基因型。

二、實驗結果

（一）案例-結果分析在案例一采用STRtyp?er-21G試劑盒檢測得到的基因分型結果中，除了D18S51基因座外，其余的19個基因座基因型均符合孟德爾遺傳規(guī)律。在D18S51基因座中，疑父的基因座分型為15，15，孩子生母基因座分型為14，14，孩子的基因座分型為14，14（如圖1）。經(jīng)PowerPlex 21試劑盒復測疑父與孩子的血樣，在D18S51基因座中，疑父的基因座分型為15，18，孩子的基因座分型為14，18（如圖2）。

圖1 案例一中的疑父、孩子生母和孩子STRtyper-21G試劑盒STR分型圖

圖2 案例一中的疑父和孩子PowerPlex21試劑盒STR分型圖

（二）案例結果分析在案例二采用STRtyper-21G試劑盒檢測得到的基因分型結果中，除了D2S1338基因座外，其余的19個基因座基因型均符合孟德爾遺傳規(guī)律。在D2S1338基因座中，疑父的基因座分型為19，19，孩子生母基因座分型為23，23，孩子的基因座分型為19，19（如圖3）。經(jīng)PowerPlex 21試劑盒、MicroreaderTM21 Direct ID System試劑盒和Micro?readerTM23sp ID System試劑盒復測三人的血樣，疑父、孩子生母和孩子的D2S1338基因座分型結果依然與21G試劑盒檢測的結果一致（如圖4、5、6）。

圖3 案例二中的疑父、孩子生母和孩子STRtyp?er-21G試劑盒STR分型圖

圖4 案例二中的疑父、孩子生母和孩子PowerPlex21試劑盒STR分型圖

圖5 案例二中的孩子生母、孩子和疑父MicroreaderTM 21 Direct ID System試劑盒STR分型圖

圖6 案例二中的孩子生母、孩子和疑父MicroreaderTM 23sp ID System試劑盒STR分型圖

三、討論

（一）等位基因丟失的判定

人類是二倍體，在每一個個體的一對等位基因中，一個來源于母親，另一個來源于父親，這個特定的等位基因對構成基因型，這是STR分型圖譜所反映的重要信息。一般來說，單一個體的每個基因座或為純合子，或為雜合子。純合子的兩個等位基因不能通過毛細管電泳所分離開來（它的兩個等位基因具有相同的片段長度），所以電泳結果只出現(xiàn)單一的一個峰。在常染色體STR圖譜分析中，良好的復合擴增體系各個基因座的片段峰信號強度應該比較接近。純合子產(chǎn)物峰的峰高和峰面積比雜合子高，雜合子的兩個等位基因峰高和峰面積接近。[3]當在親子鑒定過程中出現(xiàn)單一基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律時，首先觀察STR圖譜上該基因座的出峰情況：當該基因座上親代與子代均檢出2個等位基因，那么一般可以排除等位基因丟失的可能性，而該情況考慮為基因突變的可能性比較大；當該基因座上親代與子代均檢出1個等位基因時，比較該基因座與鄰近基因座上的等位基因峰高與峰面積的大小。若該基因座上的片段峰峰高和峰面積與鄰近基因座上的雜合子片段峰峰高和峰面積相當，且接近鄰近基因座上的純合子片段峰峰高和峰面積相的一半，那么一般考慮為等位基因丟失的可能性比較大。

觀察案例一中疑父與孩子的STRtyper-21G試劑盒檢測結果，在20個基因座中僅有D18S51基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律。在D18S51基因座的等位基因中，疑父的基因型為15，15；孩子的基因型為14，14，考慮有基因突變和等位基因丟失的可能性。但在該基因座中，疑父和孩子均只檢出1個片段峰，顯示為純合子狀態(tài)，然而這兩個峰的峰高與其各自相鄰基因座的雜合子等位基因峰峰高相仿，是另一相鄰的基因座的純合子等位基因峰峰高的一半左右（詳見圖1），由此判斷疑父與孩子在D18S51基因座中存在等位基因丟失的可能性較大。通過Power?Plex 21試劑盒復核檢測，疑父與孩子在D18S51基因座中均為雜合子（疑父為15，18；孩子為14，18），等位基因的峰面積和峰高均衡（詳見圖2）。以此證明用STRtyper-21G試劑盒檢測時，疑父與孩子在D18S51基因座中出現(xiàn)等位基因丟失的現(xiàn)象。

（二）等位基因丟失的原因

在DNA的STR重復區(qū)域內部和周圍存在著序列多態(tài)性。當待檢測的DNA模板在PCR引物結合區(qū)發(fā)生核苷酸變異（相對所設計使用的引物而言），導致引物無法與該區(qū)域的結合位點結合，DNA模板復制失敗，因此一個等位基因漏檢了（被漏檢的等位基因又稱無效等位基因）。[4]這是造成等位基因丟失的主要原因。為進一步了解案例一中疑父與孩子在D18S51基因座上等位基因18丟失的原因，在STRtyper-21G系統(tǒng)D18S51引物的外側重新設計引物：正向CAATACGCAAACCGCCTCTC、反向 CGAC?TACCAGCAACAACACAA[5]，并對疑父和孩子的樣本進行Sanger測序，結果如圖7～8所示：

圖7 案例一中疑父D18S51等位基因18測序結果

圖8 案例一中孩子D18S51等位基因18測序結果

測序結果顯示兩樣本在STRtyper-21G系統(tǒng)D18S51等位基因18的前引物結合區(qū)DNA序列（5’-TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA-3’）與GenBank數(shù)據(jù)庫參考序列和STRtyper-21G系統(tǒng)引物序列（5’-TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA-3’）不一致，檢索GenBank、Hapmap數(shù)據(jù)庫此處及周圍序列未發(fā)現(xiàn)SNP；上述樣本測序結果顯示參考序列引物結合區(qū)3’端第5個堿基為G缺失，說明樣本在該處發(fā)生了點突變。

（三）等位基因丟失的解決對策

在目前廣泛應用的多種試劑系統(tǒng)中，有些試劑系統(tǒng)所設計的引物序列特異性相對較低，這比較容易出現(xiàn)等位基因丟失的情況。為避免等位基因丟失而造成假排除，我們可以通過以下方法解決：

1.采用包含潛在無效等位基因的基因座的不同試劑系統(tǒng)進行復核檢測。

等位基因丟失可以直接影響鑒定結果的判定，但通過采用不同的STR試劑盒檢驗時，這種現(xiàn)象還是比較容易被發(fā)現(xiàn)的。如案例一中采用STRtyp?er-21G試劑盒檢驗時，疑父和孩子在D18S51基因座中均出現(xiàn)了假純合子，不符合遺傳規(guī)律；經(jīng)Power?Plex 21試劑盒復核檢驗時，疑父和孩子在D18S51基因座中均檢測出雜合子，符合遺傳規(guī)律，證實在該基因座出現(xiàn)了等位基因丟失的現(xiàn)象。

2.增加基因座檢測，降低等位基因丟失對親子鑒定的影響，增加證據(jù)的強度。

親子關系的確認依賴于孩子與可疑父親或母親之間在所有檢測的遺傳標記上是否存在共有等位基因。[6]因此，親權指數(shù)是判斷肯定父權或母權的依據(jù)。在DNA的檢驗中，沒有一對引物可以保證絕對不會出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象。當采用多種試劑盒進行檢驗時，親代與子代在同一基因座中出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律，而且只存在一個基因座不相符時，我們可以增加基因座檢測，依據(jù)GB/T 37223-2018《親權鑒定技術規(guī)范》中三聯(lián)體不符合遺傳規(guī)律計算方式來計算該基因座的親權指數(shù)，并計算累計親權指數(shù)來判定被檢者之間的親子關系。如案例二中，三位被檢者的血樣均采用了STRtyper-21G試劑盒、Power?Plex 21試劑盒和MicroreaderTM21 Direct ID System試劑盒進行檢測，孩子生母和孩子在D2S1338基因座中均出現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律；增加MicroreaderTM23sp ID System試劑盒檢驗，孩子生母和孩子在該基因座中依然是出現(xiàn)純合子的分型結果，不符合遺傳規(guī)律；綜合上述4個試劑盒的檢驗結果，除D2S1338基因座外，其余的38個基因座均符合遺傳規(guī)律。在此情況下，可以將該基因座的不符合情況看作是基因突變（四步突變）來計算三聯(lián)體的累計親權指數(shù)作出判斷，得出鑒定結論。[7]

此外，觀察案例二中疑父，孩子生母與孩子的4種試劑盒檢測結果，39個基因座中只有D2S1338基因座不符合孟德爾遺傳規(guī)律；孩子生母與孩子在D2S1338基因座的等位基因中，兩者均只有一個峰（孩子生母為23；孩子為19），并且這兩個峰的峰高與其各自相鄰的基因座的雜合子等位基因峰峰高相當，是相近的基因座的純合子等位基因峰峰高的一半左右（詳見圖3～6）。根據(jù)上述，考慮該基因座出現(xiàn)不符的原因可能是等位基因丟失；此外還有突變的可能，如單親二倍體。單親二倍體（uniparental di?somy，UPD）是指在染色體核型中，某些同源染色體或染色體上的部分片段均來源于雙親中的一方，未檢測到另一親本來源的染色體或染色體的部分片段。[8]在2號常染色體中，基因座D2S1338和D2S441，前者基因型為孩子生母（23，23）、孩子（19，19）、疑父（19，19）如圖3所示，后者基因型為孩子生母（11，11）、孩子（11，11）、疑父（10，11），如下圖所示：

孩子生母

孩子

疑父

在D2S1338基因座上，孩子與生母表現(xiàn)為不符合孟德爾遺傳規(guī)律，同時孩子與疑父的基因型一致。在D2S441基因座上孩子與生母、疑父均符合孟德爾遺傳規(guī)律，但是在該基因座上孩子的等位基因11有可能只來源于疑父，即不能排除孩子為2號染色體表現(xiàn)為父源性UPD的可能性。在該案例中，孩子若出現(xiàn)了父源性UPD，這對于本次親權鑒定是直接增加疑父的父權確信性。

綜上兩個案例表明，在親子鑒定過程中遇到特殊情況作出合理的思考判斷，并據(jù)此增加實驗進行驗證是很有必要的。親子關系的問題涉及到現(xiàn)實社會民事活動中的方方面面，諸如家庭穩(wěn)定、未成年人權益保護和社會倫理等等。關于父母與子女之間的關系，在我國現(xiàn)行法律所述中是指生物學上的父母與子女之間的親子關系。當在訴訟過程中需要通過司法鑒定手段來判定父母與子女關系時，就是要對涉案的被鑒定人進行親子關系鑒定，給出被鑒定父母與被鑒定子女之間是否存在生物學上的父母親關系的鑒定意見。倘若是在鑒定過程中出現(xiàn)等位基因丟失而錯判為該遺傳標記不符合遺傳規(guī)律時，即使根據(jù)初步數(shù)據(jù)進行親權指數(shù)的計算結果判定鑒定意見為支持疑父或疑母是孩子的生物學父親或母親的，而該司法鑒定意見書是作為證據(jù)使用的，這樣一個錯誤的判斷會影響到該司法鑒定意見書的證據(jù)效力。

因此，親子鑒定是一項與民生息息相關的司法鑒定，其過程要嚴謹、實事求是，鑒定結論要科學、準確。只有這樣做才能保證我們公民的權利得以真正地行使，履行的義務得以真正地到位。