梁闖

何首烏又名紫烏藤、花蓼、夜交藤等,為蓼科植物何首烏的干燥塊根［1］。性微溫、味苦、澀、甘,具有活血、安神、解毒、強筋骨、補益精血、滋補肝腎之效,為常見貴細中藥材［2］。近年來,關于何首烏中蒽醌類、磷脂類化合物和二苯乙烯類成分的研究報道較多,但對于何首烏多糖的研究較少［3］。多糖是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)的另一重要分子,具有多種生物活性,多糖廣泛存在于植物、微生物和海藻中,植物中多糖分布尤為廣泛,生理活性廣泛［4］。有研究表明,何首烏多糖具有抗氧化、抗衰老活性［5］。基于此,本文采用小鼠注射D-半乳糖造模,提取何首烏多糖進行灌胃,研究何首烏多糖對氧自由基及抗氧化酶活性的作用,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇昆明種小鼠40 只,雌雄各20 只,小鼠體重15～25 g,平均體重(20.14±2.14)g。將40 只小鼠隨機分為對照組、模型組、小劑量、大劑量何首烏多糖組,每組10 只。

1.2 細胞和試劑 MDA 測試盒(北京靈寶科技有限公司),SOD 測試盒(上海信裕生物科技有限公司),GSHPX 測試盒(上海艾研生物科技有限公司),其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 制備何首烏多糖 取新鮮何首烏粉碎過篩,用體積分數(shù)80%的乙醇脫脂,所得殘渣用蒸餾水提取,采用苯酚-硫酸法測定提取液中何首烏多糖含量,測得多糖含量為87.6%。

1.4 給藥方法 四組小鼠均采用灌胃法給藥,對照組和模型組予以對照液(只含防腐劑-尼泊金乙酯)灌胃,小劑量、大劑量何首烏多糖組分別予以50 mg/(kg·d)和150 mg/(kg·d)何首烏多糖灌胃,同時,模型組和小劑量、大劑量何首烏多糖組每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.5 ml,對照組皮下注射等量生理鹽水,灌胃8 周后,斷頭取血,取小鼠腦、肝、腎等部位進行各項指標測定。

1.5 小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力測定 采用亞硝酸鹽法測定,取小鼠10 μl 血清或50 μl 1%的肝、腎組織勻漿,按照測試盒說明書操作,加入試劑,將試管震蕩搖勻,37℃水浴40 min,后加入顯色劑,10 min后于550 nm 處測吸光度值,用測得結果計算小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力。

1.6 小鼠血清、肝、腎組織中MDA 測定 采用TBA比色法測定,將小鼠血清、肝、腎組織用Tris-HCL 緩沖液配成10%組織勻漿,取0.1 ml 勻漿,按照測試盒說明書操作,加入試劑,將試管震蕩均勻,水浴、煮沸40 min,后以3500 r/min 離心,共10 min,于532 nm 處測吸光度值,用測得結果計算小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量。

1.7 小鼠肝、腎組織中GSH-PX 活力測定 采用DTNB 法進行測定,取小鼠0.2 ml 1%的肝、腎組織勻漿和0.2 ml、1 mmol/L 的GSH,37℃水浴溫5 min,按照測試盒說明書操作,加入試劑,于37℃術中反應5 min,后以3500 r/min 離心,共10 min,取上清液向其中加入顯色劑,室溫下靜置15 min,于412 nm 處測吸光度值,用測得結果計算小鼠肝、腎組織中GSH-PX 活力。

1.8 小鼠腦組織中LF 測定 采用Sohal 法,取100 mg小鼠大腦,向其中加入4 ml 2∶1 氯仿-甲醇提取液,搖勻,過濾,用提取液洗滌濾渣,合并濾液,加提取液總量至5 ml,測熒光強度。

1.9 觀察指標 比較四組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力、MDA 含量,肝、腎組織中的GSH-PX 活力,腦組織中LF 熒光值。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù) ± 標準差()表示,采用t 檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對比模型組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力及肝、腎組織中的GSH-PX 活力均較對照組顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠血清、肝、腎組織中SOD 活力及肝、腎組織中的GSH-PX 活力均較模型組升高,且大劑量何首烏多糖組高于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量均較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠血清、肝、腎組織中MDA 含量均較模型組降低,且大劑量何首烏多糖組低于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對比()

表1 四組小鼠各組織中SOD、GSH-PX、MDA 對比()

注：與對照組對比,aP＜0.05；與模型組對比,bP＜0.05；與小劑量何首烏多糖組對比,cP＜0.05

2.2 四組小鼠腦組織中LF 熒光值對比 對照組小鼠腦組織中LF 熒光值為(18.04±1.65),模型組為(20.36±1.87),小劑量何首烏多糖組為(16.32±1.35),大劑量何首烏多糖組為(14.68±2.10)。模型組小鼠腦組織中LF 熒光值較對照組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；小劑量何首烏多糖組、大劑量何首烏多糖組小鼠腦組織中LF 熒光值較模型組降低,且大劑量何首烏多糖組低于小劑量何首烏多糖組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

在生物生長過程中,生物不斷產(chǎn)生氧自由基,包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-)以及有機自由基(R-、RO-、ROO-),具有極強的生物活性［5］。少量氧自由基在細胞分裂、生長、解毒、消炎等方面有較大作用,但自由基過?？烧T發(fā)生物膜系統(tǒng)與細胞內(nèi)氧化磷酸酶障礙,從而導致人體發(fā)生免疫失調(diào)、炎癥、惡性腫瘤等疾病,并誘發(fā)機體衰老和死亡［6］。

脂質(zhì)過氧化是氧自由基損傷的主要方式,主要損傷途徑為細胞膜脂質(zhì)+氧自由基-脂質(zhì)過氧化反應-過氧化脂質(zhì)-細胞成分+MDA-脂褐質(zhì)［7］。機體本身具有抗氧化系統(tǒng),存在如SOD、GSH-PX 等抗氧化酶,SOD 對機體氧化和抗氧化平衡有著重要意義,可有效清除O2-,保護細胞,避免受到氧自由基攻擊。GSH-PX對過氧化氫(H2O2)和·OH 有較強的清除能力,可有效保護細胞結構和功能完整。MDA 與LF 含量反映了機體受氧自由基攻擊的程度［8］。在疾病狀態(tài)下,由于多方面因素影響,使機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除過程失衡,就會導致組織、細胞、酶、基因等受損?？寡趸瘎┛赏ㄟ^增強體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)或清除過剩自由基而起抗氧化作用,因此,研究抗氧化劑對預防疾病有重要意義。D-半乳糖在機體內(nèi)代謝時,可產(chǎn)生大量自由基,降低機體抗氧化能力,脂質(zhì)水平增加,引起機體亞急性衰老,主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的堆積和抗氧化物酶活性的降低［9］。

何首烏是常見的一種貴細中藥材,其主要入藥部位為根塊,其有著截瘧、消癰、解毒、活絡、養(yǎng)血以及安神的功效,且何首烏經(jīng)過加工處理后,被用在補肝腎、強筋骨、烏須發(fā)以及補益精血的過程中。何首烏多糖是何首烏中提取出的一種活性成分,近年來對何首烏多糖的研究表明,何首烏多糖具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)及抗老年癡呆癥作用［10］。相關研究針對何首烏多糖進行了較為全面的深入分析,王婭等［11］從何首烏中提取分離多糖,分析其免疫調(diào)節(jié)功能的相關情況,采用二維核磁共振波譜對何首烏多糖結構進行切入分析,結合其對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 的相關影響情況,得到最終結論為何首烏多糖作為絕對分子質(zhì)量為3.96×105的α-1,4-葡聚糖,其進入體內(nèi)后可以有效促進RAW264.7 細胞的吞噬能力增加,刺激增殖情況的改善,進一步引導小鼠釋放出更多的一氧化氮(NO),證明了其存在一定的藥用價值,可以有效調(diào)節(jié)免疫活性。程凱等［12］文獻中證實何首烏多糖的使用可以有效改善小鼠體內(nèi)的氧化情況,有著較為理想的抗疲勞效應。此次研究同上述相關文獻均可以從正面或者側面證明何首烏多糖有可抑制過氧化的功能,均具有一定的研究價值。

本研究中,給予D-半乳糖造模小鼠灌胃50、150 mg/(kg·d)的何首烏多糖,小鼠血清、肝、腎組織中MDA 和腦組織中LF 不同程度下降,血清、肝、腎中SOD 和肝、腎中GSH-PX 活力提高,由此可見,何首烏多糖可抑制脂質(zhì)過氧化,并明顯清除O2-、H2O2等活性氧［11,12］。

綜上所述,何首烏多糖在抗脂質(zhì)氧化、提高內(nèi)源性抗氧化酶活性、對抗與自由基所致相關疾病方面有重要意義,相關研究人員可以將其作為研究方向進行下一步深入研究,為疾病治療的臨床提供相關指導意義與價值。