蘇永健 杜鑫 劉紅娜 張小華 張仙娟

(1.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043;2.陜西省創(chuàng)新生物技術(shù)研究院有限公司,陜西 西安 710075)

五靈膠囊由原第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院研制，清華德人西安幸福制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)。五靈膠囊由柴胡、靈芝、丹參、五味子4味藥材制成。功能主治為疏肝健脾活血。用于慢性乙型肝炎肝郁脾虛挾瘀證，癥見(jiàn)納呆，腹脹噯氣、脅肋脹痛、疲乏無(wú)力等。本方中柴胡辛行苦泄、善條達(dá)肝氣、疏肝解郁、理氣止痛為君藥；靈芝味甘性平，益氣健脾、補(bǔ)中益脾，丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛，共為臣藥；五味子酸甘性溫、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、佐助靈芝益氣補(bǔ)中、安定心神、防柴胡疏泄升散而耗氣傷陰為佐藥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明五靈膠囊對(duì)脂肪肝，肝纖維化有特殊療效[1]。

目前關(guān)于五靈膠囊質(zhì)量控制研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要以柴胡、靈芝、丹參、五味子中化學(xué)成分含量檢測(cè)為主。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,柴胡主要成分為皂苷類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類及甾醇類等，其主要藥理作用為：解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗病毒、保肝、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等[2-3]。靈芝主要成分為多糖類、三萜及甾醇類、核苷類、生物堿類、氨基酸類、脂肪酸類及微量元素類，其主要藥理作用為：抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保肝、中樞抑制、調(diào)節(jié)血脂等[4]。丹參主要成分為水溶性的丹酚酸類、脂溶性的丹參酮類及多糖類、黃酮類、甾體類、菲醌類等成分，其主要藥理作用為：心肌保護(hù)、抗凝血及抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、調(diào)血脂、降血壓、改善腦損傷、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等[5-10]。五味子主要含有木脂素類、多糖類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類等成分，其主要藥理作用為：保護(hù)心血管、保護(hù)中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化、保肝、降血糖、抑菌、抗炎、抗腫瘤等[11-13]。

與化學(xué)制劑相比，中醫(yī)的整體觀決定了需要對(duì)中藥中多種成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，但中藥及其制劑中化學(xué)成分的多樣性、復(fù)雜性以及相互間的協(xié)同作用，導(dǎo)致用單一成分或幾個(gè)成分很難準(zhǔn)確、全面地表達(dá)中藥的質(zhì)量和療效。指紋圖譜技術(shù)是近年逐漸發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)質(zhì)量控制技術(shù)，它具有信息量大，特征性強(qiáng)，能整體控制多種組分的特點(diǎn)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)參照2020年版《中國(guó)藥典》(一部)及相關(guān)文獻(xiàn)[16-19]，建立了以柴胡、丹參、五味子中化學(xué)成分為主要指標(biāo)的HPLC指紋圖譜方法，通過(guò)對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬及確認(rèn)來(lái)控制五靈膠囊的質(zhì)量。

1 材料

1.1儀器 Agilent1260 infinityⅡ型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；AG285型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；

1.2試劑與試藥 對(duì)照品：丹酚酸B(批號(hào)111562-201917，純度96.6%)，丹參酮ⅡA(批號(hào)110766-202022，純度98.9%)，柴胡皂苷a(批號(hào)110777-201912，純度94.8%)，五味子醇甲(批號(hào)110857-201815，純度99.7%)，五味子乙素(批號(hào)110765-201813，純度99.1%)五味子甲素(批號(hào)110764-201915，純度99.5%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；10批五靈膠囊為清華德人西安幸福制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)S1:200101,S2:200102,S3:200103,S4:200301,S5:200302,S6:200303,S7:200304,S8:200501,S9:200502,S10:200503)；乙腈、磷酸均為色譜純，甲醇等其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相；乙腈(A)-0.1%磷酸(B)；梯度洗脫(0～15 min，80%～50%B；15～40 min，50%～30%B；40～60min，30%～0%B；60～80 min，0%～0%B;80～85 min,0%～80% B;85～90 min,80%～80% B);體積流量0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2溶液制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液配制 取丹酚酸B、丹參酮ⅡA、柴胡皂苷a、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分別含丹酚酸B 100 μg、丹參酮ⅡA20 μg、柴胡皂苷a 400 μg、五味子醇甲300 μg、五味子甲素500 μg、五味子乙素500 μg的混合對(duì)照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2供試品溶液制備 取五靈膠囊內(nèi)容物0.4 g,精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約40 mL，超聲(頻率50 Hz,功率200 W)30 min，至室溫后再加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 參照五靈膠囊制法，分別制備缺柴胡、靈芝、丹參、五味子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 用批號(hào)為200503樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，以五味子醇甲為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<3%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<1%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 用批號(hào)為200503樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以五味子醇甲為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<5%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<2%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 用批號(hào)為200503樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以五味子醇甲為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD<5%，相對(duì)保留時(shí)間RSD<2%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4指紋圖譜建立

2.4.1共有峰標(biāo)定 選取五味子醇甲峰為參照峰(S)，色譜圖中各色譜峰保留時(shí)間與參照峰(S)保留時(shí)間的比值為相對(duì)保留時(shí)間，通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間值標(biāo)定共有峰，其中16個(gè)峰為10批樣品共有，標(biāo)定為共有峰，共有峰面積占總峰面積75%以上，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 10批五靈膠囊樣品HPLC指紋圖譜

2.4.2相似度評(píng)價(jià) 共有峰通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)分析，中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜R，見(jiàn)圖2。10批樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.998、0.999、0.998、0.998、0.997、0.995、0.999、0.982、0.997、0.986，均在0.980以上，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 對(duì)照指紋圖譜

表1 相似度分析結(jié)果

2.4.3專屬性考察 取4種陰性樣品及批號(hào)為200503樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成溶液，分別吸取4種陰性樣品及樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖3。通過(guò)與陰性樣對(duì)比可以得出，共有峰1、11、13、16歸屬丹參，共有峰2歸屬柴胡，共有峰3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15歸屬五味子。

S1:丹參陰性樣 S2：五味子陰性樣 S3：靈芝陰性樣 S4：柴胡陰性樣 S5：五靈膠囊圖3 共有峰歸屬

2.4.4共有峰指認(rèn) 分別用混合對(duì)照品溶液及樣品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖4，通過(guò)對(duì)照品峰對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，1號(hào)峰為丹酚酸B，2號(hào)峰為柴胡皂苷a，3號(hào)峰為五味子醇甲，12號(hào)峰為五味子甲素，13號(hào)峰為丹參酮ⅡA，15號(hào)峰為五味子乙素。

1:丹酚酸B 2:柴胡皂苷a 3:五味子醇甲 12:五味子甲素 13:丹參酮ⅡA 15:五味子乙素圖4 對(duì)照品及樣品HPLC圖譜

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈分別對(duì)樣品進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇處理樣品后基線更穩(wěn)定，峰數(shù)量較多，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇處理樣品。本實(shí)驗(yàn)采用回流提取法及超聲提取法分別對(duì)樣品進(jìn)行處理，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩種處理方法差異不大，因此選用簡(jiǎn)單實(shí)用的超聲提取作為提取方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min)進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 min時(shí)峰面積最大，30 min后峰面積幾乎無(wú)變化，因此選擇30 min為樣品提取時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.25%磷酸分別做梯度考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行梯度洗脫，基線平穩(wěn)，各峰分離度較好，因此采用乙腈-0.1%磷酸作為梯度洗脫流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品溶液進(jìn)行不同波長(zhǎng)(210 nm、250 nm、270 nm、305 nm)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)210 nm時(shí)峰數(shù)量最多，信息量最大，因此采用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究還對(duì)流速及柱溫等進(jìn)行了考察，最后選擇最佳流速為0.8 mL·min-1；最佳柱溫為30 ℃。

本方法的16個(gè)共有峰分別歸屬于柴胡、丹參、五味子3種藥材中，較全面反映五靈膠囊中各種成分的分布和比例關(guān)系。靈芝主要成分為多糖、三萜及甾醇類化合物，三萜及甾醇類化合物種類復(fù)雜且含量較低，紫外光(200 nm～400 nm)范圍內(nèi)吸收很弱[20-21]，故本圖譜未能體現(xiàn)五靈膠囊中靈芝的成分分布及比例關(guān)系，這些不足有待于今后采用別的方法對(duì)靈芝繼續(xù)進(jìn)行研究。本方法通過(guò)對(duì)五靈膠囊中柴胡、丹參、五味子3種藥材中多種成分的對(duì)比與分析，相比直接測(cè)定制劑中幾種化學(xué)成分的含量，具有操作簡(jiǎn)便，信息量大的優(yōu)點(diǎn)，能較全面的控制五靈膠囊的質(zhì)量。