于鯤鵬 于永鐸

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110847)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥疾病，病變多累及大腸黏膜與黏膜下層，該病病程長，治愈難，易復發(fā)，可癌變，發(fā)病年齡段多介于20～50歲。其病因尚未明確，主要包括環(huán)境，遺傳，感染，免疫，心理等多種因素[1]。最常見臨床表現(xiàn)為腹痛，腹瀉伴粘液膿血并可見發(fā)熱，消瘦，貧血等表現(xiàn)。臨床上確診UC不僅需要符合上述癥狀，還需要結腸鏡的鏡下結果來明確診斷[2]。若未能正確及時診療，可導致腸息肉，中毒性結腸擴張，結直腸癌等并發(fā)癥，嚴重影響患者生活質(zhì)量[3]。單純西醫(yī)治療并不能令人滿意。而中醫(yī)治療憑借其標本兼治，辨證論治的特點可與西醫(yī)治療形成良好的互補關系，能降低復發(fā)率，減輕患者負擔。因此加強中藥治療UC的研究就顯得尤為重要。

近年來我國中醫(yī)藥事業(yè)蓬勃發(fā)展，對中藥展開更深入的研究是大勢所趨。白花蛇舌草是治療炎癥性腸病及腸道癌變的常用中藥。中藥白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物，入胃、大腸、小腸經(jīng)。具有清熱解毒，消癰利尿，活血止痛之功效[4]?！冻敝葜尽の锂a(chǎn)志》中記載：“莖葉榨汁飲服，治盲腸炎，又可治一切腸病。”可應用于闌尾炎，尿路感染，皮膚感染等疾病的治療中?，F(xiàn)代藥理學研究表明白花蛇舌草能通過抗菌消炎，抗氧化，保護神經(jīng)系統(tǒng)，抗癌等作用發(fā)揮療效[5-7]。

網(wǎng)絡藥理學是大數(shù)據(jù)背景下以系統(tǒng)生物學為基礎并融合現(xiàn)代計算機技術的新興學科，可從生物網(wǎng)絡層面，對藥物與治療對象間的聯(lián)系進行系統(tǒng)、科學、可靠的分析，進而得到藥物有效成分，對應靶點和通路間的網(wǎng)絡關系[8]。由于網(wǎng)絡藥理學研究方法十分契合中藥有效成分復雜且成分作用部位多樣的特點，目前已被廣泛應用于中藥研究領域。目前白花蛇舌草治療UC的機制研究相對較少，在一定程度上影響了中藥進一步的推廣與發(fā)展，因此本文利用成熟的網(wǎng)絡藥理學技術對其進行進一步研究。

1 對象與方法

1.1白花蛇舌草有效成分及靶點的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP) 收集白花蛇舌草的化學成分及靶點，以口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18為指標進行篩選排除。利用UniProt數(shù)據(jù)庫將預測蛋白靶點轉(zhuǎn)換為靶點名并校正為標準名稱。

1.2UC相關靶點的篩選 以“Ulcerative colitis”為檢索關鍵詞，分別在CTD，Genecards，Disgenet數(shù)據(jù)庫中搜索與UC相關的靶點。去除重復靶點，使用Uniprot進行靶點名稱轉(zhuǎn)換。

1.3白花蛇舌草作用UC的靶點網(wǎng)絡構建 登錄Venny 2.1網(wǎng)站分析，輸入以上TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到的白花蛇舌草有效成分靶點與CTD，GeneCards，DisGeNET數(shù)據(jù)庫反饋的UC預測靶點取交集，將得到的相同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，設置物種為人“Homo sapiens”，導出共同靶點間的相互作用圖。下載TSV格式導入Cytoscape中，使用cytoHubba插件，并根據(jù)degree值選出靠前的關鍵潛在靶點。

1.4藥物與疾病相關靶點分析 應用Cluster Profiler R包對白花蛇舌草治療UC作用靶點進行分析，將上述靶點的Gene Symbol轉(zhuǎn)換為Entrez ID，用enrichGO、enrichKEGG函數(shù)分別進行GO注釋和KEGG通路富集分析，并將結果可視化，用氣泡圖，弦圖等進行展示。

2 研究結果

2.1白花蛇舌草活性成分的篩選 通過TCMSP平臺輸入白花蛇舌草篩選活性成分，以OB及DL為篩選條件，得出活性成分7個，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)，槲皮素(quercetin)，豆甾醇(Stigmasterol)，多孔甾醇(poriferasterol),2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌(2-methoxy-3-methyl-9,10-anthraquinone)，2,3-二甲氧基-6-甲基蒽醌(2,3-dimethoxy-6-methyanthraquinone)等有效成分，經(jīng)去重后得到123個藥物靶點，并通過uniprot進行標準化轉(zhuǎn)換。

2.2UC靶點的查找 使用GeneCards，DisGeNET，CTD數(shù)據(jù)庫對UC的靶點進行查詢，經(jīng)搜索去重后得到相關疾病靶點17017個。

2.3運用Venny 2.1 list1輸入藥物靶點，list2輸入疾病靶點，取交集得到119個靶點。如圖1。

圖1 白花蛇舌草的預測靶點與疾病預測鞍點的Venn圖

2.4交集蛋白靶點相作網(wǎng)絡構建 利用String數(shù)據(jù)庫獲取交集蛋白靶點網(wǎng)絡，結果包含118個節(jié)點、1105條邊，平均自由度為18.7，平均局部聚類系數(shù)為0.549。下載TSV格式導入cytoscape，運用cytoHubba插件，根據(jù)degree值選出潛在的重要靶點并作圖，前6位分別是IL-6,VEGFA,TP53,TNF,EDF,JUN。degree值分別為59,55,53,53,50,49。見圖2、圖3。

圖2 白花蛇舌草治療UC靶點的PPI網(wǎng)絡

圖3 預測的重要靶點

2.5“藥物-有效成分-對應靶點”網(wǎng)絡構建 將白花蛇舌草有效成分及對應靶點基因?qū)隒ytoscape軟件進行網(wǎng)絡構建及可視化共有126個節(jié)點，包括1個藥物節(jié)點，7個有效成分節(jié)點，118個靶點節(jié)點。共有236條邊。見圖4。

圖4 藥物-有效成分-對應靶點

2.6GO富集分析 包含生物學的三個方面:生物過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)。其中BP分析(圖5)顯示為網(wǎng)絡基因圖，CC分析(圖6)及MF分析(圖7)顯示為氣泡圖。圖6，圖7中橫坐標表示基因在其富集結果中的比率，縱坐標表示在CC，MF過程中基因顯著性排名前20的結果名稱。圓點大小表示富集數(shù)目，圓點顏色表示P-value值。越接近紅色P-value值越小，富集顯著性越高，越接近藍色則反之。由此可見BP包括：細胞對藥物的反應(Cellular response to drug)對營養(yǎng)水平的反應(response to nutrient levels)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)等；CC包括：膜筏(membrane raft)，微膜區(qū)(membrane microdomain)，膜區(qū)(membrane region)等；MF涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(neurotransmitter receptor activity)，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)，絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)等。見圖5，6，7。

圖5 GO分析生物過程(SP)網(wǎng)絡基因圖

圖6 GO分析細胞組分(CC)

圖7 GO分析分子功能(MF)

2.7KEGG通路富集分析 對119個共同靶點進行通路富集分析，圖8B中圓點大小表示富集數(shù)目，顏色表示P-value值大小，圓點間的距離代表KEGG通路中相互關系程度。可發(fā)現(xiàn)主要富集通路有糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、松弛素信號通路(Relaxin signaling pathway)，HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)，IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)，PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)TNF信號通路(TNF signaling pathway)見圖8，9。

圖8 KEGG通路富集分析網(wǎng)絡基因圖

圖9 KEGG通路富集分析通路關系網(wǎng)絡

3 討論

研究表明，UC發(fā)病率在我國乃至世界均呈逐年增高的趨勢，其中老年人是發(fā)病率增長最快的群體[9-10]，因此越來越多的學者開始對UC展開深層次的研究。西醫(yī)治療UC的藥物主要有柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑，皮質(zhì)類固醇類藥物，嚴重者可用硫唑嘌呤、JAK抑制劑等[11-12]，此外已有學者開始研究相關的靶向治療方法[13]。但其療效不穩(wěn)定，復發(fā)率較高，副作用大[14-15]，而中醫(yī)藥以其個體化對癥治療的原則可以在一定程度上彌補西醫(yī)治療的短板。UC多歸屬于中醫(yī)理論中的“腸澼”“久痢”“臟毒”等范疇[16]，傳統(tǒng)中醫(yī)認為其病機為脾腎虧虛，濕熱之邪氣蘊結大腸，化熱可形成癰毒，侵襲腸道，腸絡受損，迫血外溢，形成腸癰，其臨床表現(xiàn)與UC十分吻合[17]。《諸病源候論》中腸癰侯記載“大便膿血，似赤白下，而寮非者，是腸癰也?！蔽闹忻枋龅膬?nèi)容與UC腹瀉伴粘液膿血的表現(xiàn)極為相似；《醫(yī)略》中云：“論痢之證治之理，正與癰瘍機相暗合。”這表明濕熱癰毒是可能造成UC的重要病機之一。固本文以“以癰論治潰瘍性結腸炎”為研究方向，希望為治療UC提供新的用藥思路。白花蛇舌草清熱解毒，散結消腫，能治療各種內(nèi)外癰，尤善治腸癰，可用于濕熱毒盛所導致的UC，以及后期發(fā)展而成的結直腸癌等嚴重病癥[18]。

本研究通過對白花蛇舌草主要有效成分的作用靶點進行篩選，并與UC疾病靶點進行交集處理，構建白花蛇舌草與UC的“疾病-有效成分-靶點”圖，并對靶點進行GO富集分析與KEGG通路分析。本研究顯示，白花蛇舌草中的槲皮素，β-谷甾醇，豆甾醇，多孔甾醇等物質(zhì)為治療UC的有效成分。Dicarlo等[19]通過腸道類器官研究表明槲皮素可以有效抑制炎癥反應中TNF-α and LCN-2 mRNA.的表達，同時抑制IL-17,IL-22等炎癥基因誘導的多糖。除此之外，槲皮素還能降低腸上皮C/EBP-β轉(zhuǎn)錄因子的表達而發(fā)揮抗炎作用，改善UC癥狀;β-谷甾醇是一種植物甾醇，目前已較廣地應用于醫(yī)療衛(wèi)生領域中。實驗證明，β-谷甾醇可通過調(diào)節(jié)白細胞的趨化性，增加血管密度通透性，抑制TNF-α,IL-6,和IL-1β表達而發(fā)揮其抗炎作用，此外UC病情的發(fā)展與腸道內(nèi)菌群間的不良反應有關。β-谷甾醇能增加腸上皮細胞中的AMPs，從而抑制腸道內(nèi)沙門氏菌的存活率，改善腸道環(huán)境，有利于UC患者治療與恢復[20];目前UC被認為屬于自身免疫性疾病的范疇，而豆甾醇作為一種天然存在于多種藥用植物中的類固醇。其已被證明是具有巨大治療潛力的免疫調(diào)節(jié)劑[21]。 這可能對UC的治療提供一定的幫助。

通過構建白花蛇舌草PPI網(wǎng)絡構圖可發(fā)現(xiàn)，不同的活性成分除了對應不同靶點外還可對應相同的靶點，這說明白花蛇舌草有效成分能通過多靶點對UC治療發(fā)揮立體的治療作用。其重要潛在靶點有IL-6,VEGFA,TNF，TP53等。IL-6作為炎癥細胞因子中的重要因子，能活化細胞膜表面的gp130，使相關酶活化后與STAT3蛋白結合，進而激活NK-κB信號通路來參與UC的炎癥發(fā)展進程[22]。 血管生成過程作為腸道炎癥發(fā)展中的重要一環(huán)，會影響腸道黏膜修復與重塑，導致腸內(nèi)炎癥反應的加劇。Mateescu等[23]認為腸道中VEGF和內(nèi)皮素(CD105)與UC炎癥加劇存在密切關系，并可作為輔助治療的靶點;此外VEGF可能還參與了誘導UC發(fā)展為腸癌的過程。結直腸癌是UC發(fā)展到終末期的嚴重并發(fā)癥。p53和p16基因是腫瘤發(fā)生中的主要基因，不但可參與細胞衰老凋亡的周期性調(diào)控，還與炎癥發(fā)展有關，當這些基因發(fā)生突變則可促使腸道癌變的發(fā)生。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，在UC患者中p53，p16，VEDF的表達均為陽性并且可誘導促炎性TNF-α和IL-6的陽性表達進而加重UC病情及其癌變的可能性[24-25]。TNF-α是一種促炎癥介質(zhì),能夠促進炎癥反應，并最終促使癌變的發(fā)生，為UC病情發(fā)展中的重要炎癥因子[26]。目前臨床中已經(jīng)使用抗TNF-α藥物以減少類固醇暴露和依賴性，從而對控制UC病情和提高患者生活質(zhì)量有一定幫助[27]。以上結果表明白花蛇舌草的有效成分能可能通過這些重要靶點的表達，對UC的發(fā)展進程產(chǎn)生一定的影響。

GO富集分析中顯示其共同靶點的細胞組分有細胞的膜筏，微膜區(qū)，膜區(qū)，涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，G蛋白偶聯(lián)胺受體活性，絲氨酸水解酶活性等分子功能，并通過細胞對藥物的反應，對營養(yǎng)水平的反應，活性氧代謝過程等生物過程對UC治療起到作用。以上分析證明白花蛇蛇舌草可通過不同的生物學過程發(fā)揮其不同的分子作用來治療UC，為中藥能通過多維立體的方式對疾病進行治療提供了較為詳細的理論依據(jù)。

通過在KEGG通路分析中得到的結果，我們主要對其靶點富集程度較高的通路進行討論分析。細胞和組織處于缺氧環(huán)境下會導致細胞凋亡壞死，在UC發(fā)展過程中腸道內(nèi)細胞會處于缺氧狀態(tài)，缺氧環(huán)境會使腸道內(nèi)細胞發(fā)生氧化應激反應，最終加重腸道粘膜損害。經(jīng)研究結果表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs是一種通過Maillard反應生成的具有高度異質(zhì)性的活性物質(zhì)，其能產(chǎn)生持續(xù)的氧化應激反應，導致相應的血管組織受損。其與AGEs受體(RAGE)結合并激活AGE-RAGE通路而損傷腸道粘膜，同時可激活NADPH氧化酶(Nox)和NF-κB，進一步加重體內(nèi)氧化應激反應，最終對腸道的微小血管造成一定的破壞[28];HIF-1信號通路除了作為腫瘤相關信號通路外，也是改善缺氧狀態(tài)的重要通路，能調(diào)控耐氧機制、炎癥修復機制和部分炎癥反應[29]。在HIF-1信號通路中HIF-1α免疫因子與細胞缺血缺氧環(huán)境相關，HIF-1α可誘導VEGF和EPO基因表達來促進血管和紅細胞生成，同時抑制細胞的凋亡[30]，以此來參與UC的炎癥調(diào)控過程。腸道炎癥被認為是導致UC的重要治病因素，本研究表明眾多炎癥相關通路可參與UC的炎癥過程。眾所周知，PI3K/Akt信號通路可參與細胞增殖、分化、凋亡和自噬過程，對其作用研究主要集中在腫瘤調(diào)節(jié)上。但Chen等[31]研究發(fā)現(xiàn)其還可以通過調(diào)節(jié)下游效應分子NF-κB、Bad、caspase9、m-TOR等分子的活性來調(diào)控炎癥反應，此外還可促進免疫細胞如T細胞的增殖分化而導致炎癥反應的發(fā)生，進而加重UC的炎癥發(fā)展[32-33];IL-17介導的信號通路是重要的炎癥通路，其相關因子在UC炎癥發(fā)展過程中有重要意義[34]。IL-17/STAT3信號通路與腸道黏膜炎癥及UC的癌變過程密切相關，通過IL-17介導使STAT3磷酸化來參與UC的嚴重癌變結果大腸癌的發(fā)展過程[35];松弛素是一種肽類激素，能顯著抑制纖維化過程中肌成纖維細胞的活性并調(diào)節(jié)炎癥過程[36]。實驗表明，激活松弛素信號通路能抑制NLRP3炎癥體的活動，進而降低IL-1β活性;同時抑制NF-κB信號的傳導，松弛素還能通過調(diào)控免疫細胞如肥大細胞脫顆粒來減少組胺，白三烯等促炎及過敏因子的表達，從而起到控制炎癥的效果，發(fā)揮對于UC的治療作用[37-38];TNF信號通路同樣與炎癥與和癌癥發(fā)展進程有關。TNF-α是一種與炎癥及粘膜水腫發(fā)生有關的細胞因子，此類炎癥介質(zhì)可削弱體內(nèi)的抗腫瘤免疫能力;并可激活NF-κB活性最終導致腸內(nèi)癌變的發(fā)生[39-40]。孫婕怡等[41]通過實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過治療使UC病情好轉(zhuǎn)后，患者體內(nèi)TNF-α因子的含量有明顯的下降趨勢。這說明TNF-α與UC存在密切的關系。綜上所述，通過對白花蛇舌草治療 UC 的關鍵靶點及其相關信號通路進行預測，揭示了糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信號通路為白花蛇舌草治療UC的潛在重要通路，可通過調(diào)控氧化應激反應，炎癥反應過程及肌體細胞免疫過程等發(fā)揮其多靶點，多通路共同治療UC的作用。

4 結論

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡藥理學技術得到白花蛇舌草治療UC的有效化合物7個以及相應藥物靶點123個，并與17017個疾病靶點相交得到119個共同靶點。經(jīng)分析后得出白花蛇舌草中的有效成分可能通過糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、PI3K-Akt、Relaxin，TNF等信號通路調(diào)控重要基因IL-6,VEGFA,TP53,TNF,EDF,JUN等靶點基因的表達而發(fā)揮抗炎，抗氧化應激反應，調(diào)節(jié)免疫等作用來對UC進行治療。本研究與現(xiàn)有機制研究相吻合，具有可信度，能證明預測的有效性，為今后進一步研究白花蛇舌草治療UC提供一定的科學依據(jù)，旨在更好的服務于臨床用藥。當然本文仍有一定的不足之處，如本文未具體討論白花蛇舌草在通路中的代謝產(chǎn)物；雖然為臨床常用藥物，但對于白花蛇舌草相關的藥理機制研究相對較少，基于白虎蛇舌草對UC的基礎研究參考樣本也較少，使得部分成果研究還有待進一步加強等，其中復雜的作用機制過程仍有待于未來更加細致的研究。