程江雪 武旭 郭東艷 史亞軍 鄒俊波 吳睿彬 張小明

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽(yáng) 712046)

心絞痛(angina pectoris,AP)是冠心病中最為常見(jiàn)的一種表現(xiàn)，發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康和生活[1-3]。心絞痛初載于漢張仲景《金匱要略》中，主要表現(xiàn)為心脈痹阻。中醫(yī)認(rèn)為“心痹者，脈不通”，多為寒邪內(nèi)侵或情志失調(diào)，瘀毒互結(jié)從化也是冠心病心絞痛等心腦血管血栓性疾病發(fā)病的重要病機(jī)[4-7]。血瘀常與熱毒相兼，而熱毒血瘀證也可見(jiàn)于冠心病心絞痛、糖尿病、惡性腫瘤等多種疾病[8-12]。

前期研究可知，當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)是治療中醫(yī)心系病的常用藥對(duì)，且對(duì)于熱毒血瘀證大鼠具有一定的治療作用，對(duì)治療心絞痛的中藥復(fù)方的開(kāi)發(fā)具有重要意義[13-14]。為進(jìn)一步研究當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的作用機(jī)制及其作用靶點(diǎn)，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，從分子水平探討當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為該藥對(duì)治療心絞痛的后續(xù)研究提供合理依據(jù)。

1 資料與方法

1.1當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)活性成分的篩選 通過(guò)登陸檢索計(jì)算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行中藥有效成分地篩選，在herb name搜索條件下分別以當(dāng)歸、赤芍為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，用口服給藥利用度(OB)≥30%和類(lèi)藥性(DL)≥0.18作為篩選指標(biāo)篩選其有效成分。并將上述活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行提取，得到該藥對(duì)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)與心絞痛的共同作用靶點(diǎn) 分別登陸Genecard(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)、Therapeutic Target Database(https://db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)以及DisGenet(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/search)數(shù)據(jù)庫(kù)以“angina pectoris”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取心絞痛的相關(guān)靶點(diǎn)。應(yīng)用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。收集整理刪除重復(fù)項(xiàng)后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中添加靶點(diǎn)簡(jiǎn)稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立疾病靶點(diǎn)。

登陸Venny2.1[18]在線(xiàn)作圖軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/VENNY2.1)將當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)的活性成分靶點(diǎn)和心絞痛相關(guān)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，存在交集的共同基因靶點(diǎn)可能是當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)活性成分治療心絞痛的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物、有效成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病整理輸入進(jìn)Cytoscape 3.7.1中，以“節(jié)點(diǎn)”(node)代表藥物、活性成分、活性成分靶點(diǎn)與疾病，用“邊”(edge)表示兩節(jié)點(diǎn)之間存在的關(guān)聯(lián)，建立活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，更為系統(tǒng)地對(duì)當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.4蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)建立 登陸STRING(https://string-db.org/STRING11.0)數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)平臺(tái)，導(dǎo)入藥物疾病共同靶點(diǎn)，以Multiple protein為前提，選擇物種為人類(lèi)(homo sapiens)，得到蛋白相互作用(protein-protein interaction)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置選取置信度0.7，舍去游離蛋白，導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖及tsv格式表格進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白相互作用分析。

1.5GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析 為了更明確地表現(xiàn)出各靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能效應(yīng)以及在各信號(hào)通路中的作用影響，對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析以及KEGG富集分析可視化處理。登陸http://www.bioconductor.org/使用R命令安裝其clusterProfiler，bioconductor等程序包和數(shù)據(jù)庫(kù)，使用R腳本將藥物疾病交集靶點(diǎn)基因的symbol轉(zhuǎn)化為基因的ID，進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析，得到條形圖和氣泡圖，分析當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛潛在的生物過(guò)程及信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中初步檢索得到當(dāng)歸的化學(xué)成分共125個(gè)，赤芍的化學(xué)成分共119個(gè)，經(jīng)口服利用度OB≥30%，類(lèi)藥性DL≥0.18篩選后當(dāng)歸有效成分2個(gè)，赤芍有效成分28個(gè)，有共同有效成分2個(gè)，分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)，收集得到有效成分共28個(gè)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)的有效化學(xué)成分

2.2當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)與心絞痛的共同作用靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到具有靶點(diǎn)的有效成分有14個(gè)，當(dāng)歸相關(guān)靶點(diǎn)47個(gè)，赤芍相關(guān)靶點(diǎn)382個(gè)，合并兩藥相同作用靶點(diǎn)，得到作用靶點(diǎn)382個(gè)。以心絞痛“angina pectoris”為關(guān)鍵詞，由GENECARD數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，去除重復(fù)項(xiàng)得到心絞痛能編碼蛋白質(zhì)的疾病相關(guān)靶點(diǎn)共6862個(gè)。將藥物與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射(圖1)，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)243個(gè)。

圖1 藥物疾病相關(guān)靶點(diǎn)交集

2.3活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape得到的藥物-有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2，包括當(dāng)歸-赤芍活性成分14個(gè)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)共有259個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中243個(gè)對(duì)應(yīng)藥物疾病的靶點(diǎn)，相連的邊代表藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用的對(duì)應(yīng)關(guān)系?？梢灾庇^的看出藥物、活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。黃芩素(Baicalein)的作用靶點(diǎn)最多，度值為75，芍藥內(nèi)酯苷(Albiflorin)、菠甾醇(Spinasterol)、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose)、豆甾-7-烯-3-醇(stigmast-7-en-3-ol)、芍藥苷(paeoniflorin)靶點(diǎn)度值分別為52、49、48、45、43。這些連接靶點(diǎn)較多的活性成分可能在當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛中發(fā)揮著較為重要的作用。在蛋白靶點(diǎn)中，PTPN1、ESR1、ESR2、AR、CYP19A1分別與11、10、9、8、8個(gè)成分相連，且在該網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)蛋白靶點(diǎn)至少有2個(gè)活性成分與之相連，每個(gè)活性成分至少有3個(gè)作用靶點(diǎn)，表明該藥對(duì)治療心絞痛是多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖2。

注：紫色代表活性成分，紅色代表作用靶點(diǎn)圖2 當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)string數(shù)據(jù)庫(kù)輸入243個(gè)心絞痛疾病與當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)藥物兩者靶點(diǎn)交集，按互作分?jǐn)?shù)minimum required interaction score>0.7得到其PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，該網(wǎng)絡(luò)圖含有189個(gè)節(jié)點(diǎn)，571條邊，平均度值6.04?！癱onfidence”是由線(xiàn)條粗細(xì)反映蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖連線(xiàn)看每個(gè)基因的連接基因數(shù)目，連接基因數(shù)目越多，則此基因在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵，關(guān)聯(lián)度越大。該網(wǎng)絡(luò)中，度值較高的蛋白靶點(diǎn)有酪氨酸受體激酶SRC(Tyrosine-protein kinase SRC，SRC)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(Serine/threonine-protein kinase AKT，AKT1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)和轉(zhuǎn)化蛋白p21(Transforming protein p21/H-Ras-1，HRAS)，度值分別為50、49、48、46、45。

圖3 當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖2.5 GO(GeneOntology)功能富集分析

對(duì)當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛涉及的243個(gè)靶點(diǎn)蛋白，經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行Cluego插件得到GO功能富集分析134個(gè)。根據(jù)p值進(jìn)行排序，以前20個(gè)功能的柱狀圖和氣泡圖進(jìn)行可視化展示，結(jié)果見(jiàn)圖4。可以看出，靶點(diǎn)蛋白涉及的基因功能包括內(nèi)肽酶活性(endopeptidase activity)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、絲氨酸型肽酶活性(serine-type peptidase activity)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白酪氨酸激酶活性 (protein tyrosine kinase activity)等。

圖4 與心絞痛相關(guān)的當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)活性成分潛在靶點(diǎn)GO富集柱狀圖

2.5KEGG通路富集分析 對(duì)當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛涉及的243個(gè)靶點(diǎn)蛋白，由R語(yǔ)言運(yùn)行Cluego分析插件得到KEGG通路富集結(jié)果146個(gè)，根據(jù)p值和涉及的靶點(diǎn)基因數(shù)進(jìn)行排序，將富集程度前20以柱狀圖和氣泡圖的形式展示，見(jiàn)由圖5。分析結(jié)果顯示，與當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)靶基因相關(guān)通路主要集中在人類(lèi)疾病、環(huán)境信息過(guò)程、細(xì)胞代謝過(guò)程及生物過(guò)程。參與的人類(lèi)疾病包括前列腺癌(Prostate cancer)、癌癥蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、非小細(xì)胞性肺癌(Non-small cell lung cancer)、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)等，參與的環(huán)境信息過(guò)程包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT(蛋白激酶B)信號(hào)通路)(PI3K-Akt signaling pathway)、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、Ras相關(guān)蛋白1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)、Ras信號(hào)通路(Ras signaling pathway)、VEGF信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、EebB信號(hào)通路(ErbB signaling pathway)等，參與的循環(huán)系統(tǒng)包括血管平滑肌收縮通路(Vascular smooth muscle contraction)等，參與的免疫系統(tǒng)包括補(bǔ)體途徑(Complement and coagulation cascades)等。該結(jié)果反映了中藥多靶點(diǎn)多通路參與體內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，也表明當(dāng)歸-赤芍可能是通過(guò)影響這些生物過(guò)程發(fā)揮對(duì)冠心病心絞痛的治療作用。

圖5 與心絞痛相關(guān)的當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)活性成分潛在靶點(diǎn)KEGG富集柱狀圖

2.6靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape得到的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)共有335個(gè)節(jié)點(diǎn)，相連的邊代表靶點(diǎn)-通路相互作用的對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)果可知核心靶點(diǎn)包括MAPK3、AKT1、HRAS、VEGFA、MAPK2K1、PRKCA、PRKCB、IKBKB、PRKCG、TNF等。

注：藍(lán)色代表通路，紅色代表作用靶點(diǎn)圖6 當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

近年來(lái)，中藥防治各類(lèi)型心絞痛的臨床療效已逐步被認(rèn)可。當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)是養(yǎng)血活血方劑中的常用藥對(duì)，在《中醫(yī)方劑大辭典》中含有該藥對(duì)的處方有342首[15]。當(dāng)歸為活血行瘀之良藥，偏于補(bǔ)血、活血；赤芍多用于活血化瘀止痛，治療血滯疼痛，偏于清熱涼血祛瘀，二者常在治療因偏血熱的血虛而兼有瘀滯之癥時(shí)配伍使用[16-18]。目前，關(guān)于當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的研究較少。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的作用機(jī)制，能夠?qū)υ撍帉?duì)治療心絞痛的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的系統(tǒng)模型進(jìn)行詳細(xì)展示，為該藥對(duì)的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用可提供可靠依據(jù)和方向。

在本研究中，當(dāng)歸-赤芍治療心絞痛的活性成分14個(gè)，主要包括芍藥內(nèi)酯苷、菠甾醇、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖、豆甾-7-烯-3-醇、芍藥苷等。芍藥苷是赤芍中的主要成分，具有降低血液黏度、擴(kuò)張血管、促血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[19-23]；芍藥內(nèi)酯苷與芍藥苷結(jié)構(gòu)相似，為同分異構(gòu)體，均可通過(guò)調(diào)節(jié)ET-1、NO的釋放保護(hù)血瘀證大鼠血管內(nèi)皮功能，進(jìn)而改善大鼠的血瘀狀態(tài)[20]；菠甾醇具有止痛、抑制CACO-2細(xì)胞增殖作用，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞等均具有一定的細(xì)胞毒性[24-26]；1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖通過(guò)促凋亡、抗轉(zhuǎn)移等作用機(jī)制，對(duì)前列腺癌、黑色素瘤、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用[27-29]。

當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛涉及的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白包括MAPK3、AKT1、HRAS、VEGFA、MAPK2K1、PRKCA、PRKCB等，均為心絞痛病理過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。MAPK3是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[30-32]。AKT1是AKT三個(gè)同種型蛋白結(jié)構(gòu)中的一種，活化后可以調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管生長(zhǎng)，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)減慢心功能受損速度，同時(shí)通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡來(lái)增加心肌細(xì)胞活性，能夠調(diào)節(jié)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等多種生理過(guò)程[33-36]。HRAS是致癌基因Ras編碼的蛋白之一，HRAS基因的突變和高表達(dá)可成為啟動(dòng)腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素[37]。VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)中參與血管新生的主要調(diào)控因子，VEGFA能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)血管新生及維持血管等作用，在冠心病心絞痛病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[38-40]。該結(jié)果符合中藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)的特征，蛋白之間相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的基因功能主要體現(xiàn)在內(nèi)肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和蛋白酪氨酸激酶活性等方面。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛相關(guān)的信號(hào)通路多富集在疾病發(fā)生(如：前列腺癌、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥)，血流動(dòng)力學(xué)改變(如：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)，細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)(如：絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路)等方面。心絞痛常為血瘀引起，血瘀證與血流動(dòng)力學(xué)的改變相關(guān)，且癌癥也常以心絞痛為癥狀，由此可知，當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)涼血活血作用與其治療心絞痛作用通路一致。

綜上，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)治療心絞痛的關(guān)鍵化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，探索該藥對(duì)治療心絞痛的復(fù)雜作用機(jī)制，表明當(dāng)歸-赤芍藥對(duì)可能通過(guò)抗癌、改善血液流變學(xué)、促進(jìn)血管生成等實(shí)現(xiàn)治療心絞痛的作用。