王 列 馬 帥 馬鐵明△ 馬俊杰 胡 哲 林德龍

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，沈陽(yáng) 1108472遼寧省針灸養(yǎng)生康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 1108473沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 1100034 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100105

肌筋膜激痛點(diǎn)(myofascial trigger points，MTrPs)為肌肉組織緊繃區(qū)域中異常的敏感小點(diǎn)[1]。在臨床上，若MTrPs引發(fā)所在骨骼肌疼痛、抽搐反應(yīng)以及遠(yuǎn)端牽涉痛等癥狀，可認(rèn)為該MTrPs處于激活狀態(tài)，由該MTrPs引發(fā)的系列癥狀稱(chēng)之為肌筋膜疼痛綜合征(myofascial pain syndrome，MPS)[2]。當(dāng)MTrPs處于激活狀態(tài)一旦超過(guò)3個(gè)月，則使急性MPS轉(zhuǎn)變成慢性MPS，此時(shí)患者不僅慢性疼痛癥狀明顯，且易伴有焦慮、抑郁、睡眠障礙等問(wèn)題。

目前，MTrPs形成機(jī)制尚不明確，但它是MPS發(fā)病的直接病因。臨床多用肌松藥或非甾體抗炎藥來(lái)治療MPS[2]，其可改善肌肉局部攣縮，緩解疼痛癥狀，但不能從根本上滅活MTrPs。針灸技術(shù)能打破MTrPs局部能量危機(jī)，改善微循環(huán)，降低炎癥因子水平，是有效的MTrPs滅活措施[3]，但其作用機(jī)制的研究多停留在周?chē)植拷M織層面，尚缺乏脊髓及以上的機(jī)制研究。近年研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在MTrPs活化與誘發(fā)牽涉痛及中樞敏化中起著重要作用[4]。本研究通過(guò)建立慢性MPS大鼠模型，觀察電針激痛點(diǎn)治療慢性MPS是否與調(diào)節(jié)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)補(bǔ)體受體-3的單克隆抗體(OX-42)表達(dá)有關(guān)，以探討電針治療慢性MPS的可能機(jī)制，為今后的深入研究奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠24只(SPF級(jí)，7周齡，體質(zhì)量220 g～250 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。大鼠在室溫(25±1)℃、相對(duì)濕度(50%±3%)條件下自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

兔抗鼠GFAP單克隆抗體(武漢華美生物工程有限公司)；兔抗鼠OX-42單克隆抗體(GeneTex公司)；PBS緩沖液、DAB顯色劑素(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

FT-200動(dòng)物跑步機(jī)(成都泰盟軟件有限公司)；BL-420 S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；電針儀(汕頭醫(yī)用設(shè)備廠有限公司)；華佗牌無(wú)菌針灸針0.35 mm×40 mm(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；徠卡全自動(dòng)免疫組化及原位雜交染色機(jī)(德國(guó)Leica)；多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)伯托公司)；自制打擊裝置。

1.3 模型復(fù)制及分組

將24只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組，每組8只。采用黃強(qiáng)民團(tuán)隊(duì)[5]提出的鈍性打擊結(jié)合離心運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行造模。每周先進(jìn)行一次鈍性打擊，第二天將打擊后的大鼠放在傾斜角為16°的動(dòng)物跑臺(tái)上，離心運(yùn)動(dòng)90 min，速度逐漸增大至16 m/min，余下5天休息。重復(fù)干預(yù)8周后，恢復(fù)4周。模型復(fù)制滿(mǎn)足以下3個(gè)條件即為成功：①出現(xiàn)局部肌緊張帶或結(jié)節(jié)；②靜息狀態(tài)下出現(xiàn)自發(fā)電位；③針電極刺激緊張帶處出現(xiàn)局部抽搐反應(yīng)。

1.4 電針干預(yù)

造模成功后，電針組大鼠采用0.35 mm×40 mm毫針斜刺并貫穿激痛點(diǎn)結(jié)節(jié)，提插、捻轉(zhuǎn)引發(fā)局部抽搐反應(yīng)后，連接電針儀，施以頻率2～20 Hz的疏密波，電流強(qiáng)度以大鼠左下肢出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為宜，留針15 min，1次/d，連續(xù)治療7 d。正常組、模型組大鼠在相同時(shí)間和地點(diǎn)采取相同方式進(jìn)行抓取和固定，但不采取任何治療措施。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 自發(fā)電活動(dòng)頻率檢測(cè) 治療結(jié)束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，仰臥位固定后在左下肢股內(nèi)側(cè)肌部位尋找肌肉緊張帶或結(jié)節(jié)，使用BL-420 S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，電極針緩慢插入緊張帶或結(jié)節(jié)處，每次移動(dòng)電極針約1mm，當(dāng)肌電圖出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)電活動(dòng)時(shí)，記錄發(fā)生的自發(fā)電活動(dòng)頻率，并予以標(biāo)記。

1.5.2 動(dòng)物取材 自發(fā)電位檢測(cè)后，在標(biāo)記處切取1 cm3肌肉組織，置于4%多聚甲醛固定。隨后大鼠俯臥位，依次切開(kāi)并剝離背部正中皮膚、筋膜和肌肉，打開(kāi)椎管，取L4～6腰膨大段脊髓組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定保存，供免疫組化檢測(cè)使用。

1.5.3 蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察激痛點(diǎn)周?chē)∪饨M織病理變化 主要步驟：修材；4%多聚甲醛固定；梯度酒精法脫水；二甲苯透明；浸蠟包埋；石蠟機(jī)切片，厚度5μm；脫蠟；蘇木精染色；透明、封固。400倍光鏡下觀察骨骼肌形態(tài)及病理變化。

1.5.4 免疫組化法檢測(cè)大鼠脊髓背角GFAP、OX-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá) 主要步驟：脫蠟水化；滴加3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育20 min；滴加一抗(GFAP 1∶3000，OX-42 1∶1000)；滴加二抗，37℃溫箱孵育；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野4個(gè)，觀察GFAP、OX-42在脊髓背角中的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠自發(fā)電位及活動(dòng)頻率比較

肌電圖結(jié)果顯示：正常組在靜息狀態(tài)下無(wú)異常自發(fā)電位；與正常組比較，模型組出現(xiàn)一系列高頻低幅的背景電位(箭頭處)和振幅相對(duì)較高的峰電位(虛線箭頭處)，可持續(xù)超過(guò)30 s，但是不超過(guò)10 min；見(jiàn)圖1A。與正常組比較，模型組自發(fā)電位活動(dòng)頻率明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，電針組有2只大鼠異常自發(fā)電活動(dòng)消失，其余均可見(jiàn)偶發(fā)的自發(fā)電活動(dòng)，且頻率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1B。

靈敏度200 μV/D；掃描速度250 ms/D圖1A 各組大鼠左下肢股內(nèi)側(cè)肌肌電圖

與正常組比較▲P<0.05；與模型組比較■P<0.05圖1B 各組大鼠左下肢股內(nèi)側(cè)肌自發(fā)電位活動(dòng)頻率比較

2.2 各組大鼠左下肢股內(nèi)側(cè)肌病理形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠橫切面肌細(xì)胞多呈規(guī)則多邊形，大小均勻，排列緊密、整齊，每個(gè)細(xì)胞邊緣可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞核，且細(xì)胞核位于肌膜下(圖2A橫切面箭頭)?？v切面肌纖維排列緊密、規(guī)律，粗細(xì)均勻一致，細(xì)胞核大多分布于肌纖維膜下(圖2B縱切面箭頭)。

模型組大鼠橫切面可見(jiàn)多個(gè)大小不等的增大、圓染的肌細(xì)胞，增大肌細(xì)胞的周?chē)喑霈F(xiàn)相對(duì)較小的圓形或橢圓形肌細(xì)胞(圖2C橫切面箭頭)，并出現(xiàn)不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與核內(nèi)移現(xiàn)象(圖2C橫切面虛線箭頭)?？v切面可見(jiàn)肌纖維粗細(xì)不等，排列紊亂，攣縮結(jié)節(jié)處出現(xiàn)大面積的粘連區(qū)域，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象(圖2D縱切面箭頭)。

電針組大鼠橫切面顯示，肌細(xì)胞形態(tài)已基本接近于正常(圖2E橫切面箭頭);縱切面顯示，電針組肌纖維逐漸恢復(fù)，形態(tài)接近于正常組，但仍可見(jiàn)輕微萎縮、變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象(圖2F縱切面箭頭)。

圖2 各組大鼠左下肢股內(nèi)側(cè)肌病理形態(tài)學(xué)變化(×400倍)

2.3 各組大鼠脊髓背角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

正常組大鼠脊髓背角中可見(jiàn)散在的淺棕褐色GFAP陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞，突起細(xì)而小，胞體形態(tài)不清晰，模型組大鼠脊髓背角中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞明顯密集，呈深棕褐色，表達(dá)增強(qiáng)，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05))，染色略淺。見(jiàn)圖3A、圖3B。

圖3A 各組大鼠脊髓背角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(×100倍)

與正常組比較▲P<0.05；與模型組比較■P<0.05圖3B 各組大鼠脊髓背角GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較

2.4 各組大鼠脊髓背角OX-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

正常組大鼠在脊髓背角中可見(jiàn)少量OX-42陽(yáng)性細(xì)胞；模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量密集，染色加深，胞體變大，突起縮短，從分支狀變成變形蟲(chóng)樣形態(tài)，與正常組相比，表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05))；電針組OX-42陽(yáng)性細(xì)胞與模型組相比，表達(dá)下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4A、圖4B。

3 討論

MPS屬中醫(yī)學(xué)“筋痹”范疇，病位在筋，《靈樞·刺節(jié)真邪》云：“一經(jīng)上實(shí)下虛而不通者，此必有橫絡(luò)盛加于大經(jīng)之上，令之不通”，指出本病因“橫絡(luò)”卡壓致經(jīng)脈氣血不通所致。“橫絡(luò)”現(xiàn)代醫(yī)學(xué)解釋為肌肉組織因長(zhǎng)期勞損或外傷形成的條索、結(jié)節(jié)或粘連等結(jié)筋病灶點(diǎn)，這與MTrPs的病理特點(diǎn)極為相似[6]。中醫(yī)采用“以痛為腧”的理論和“解結(jié)”之法來(lái)解除橫絡(luò)治療筋痹。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為直接精準(zhǔn)靶向性滅活MTrPs是治療慢性MPS的關(guān)鍵。臨床研究[7]證實(shí)，電針治療慢性MPS療效確切，鎮(zhèn)痛效果良好，故本實(shí)驗(yàn)選用電針激痛點(diǎn)。

圖4A 各組大鼠脊髓背角OX-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(×400倍)

與正常組比較▲P<0.05；與模型組比較■P<0.05圖4B 各組大鼠脊髓背角OX-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較

MTrPs有隱性和活躍之分[1]。隱性MTrPs可被激活，不僅造成其所在肌肉組織局部疼痛，還引發(fā)遠(yuǎn)端牽涉痛[2]。牽涉痛發(fā)病機(jī)制與脊髓背角水平的中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏化密切相關(guān)[8]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)的激活是中樞敏化的重要機(jī)制之一[9]。GFAP和OX-42分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞常用的特異性標(biāo)志蛋白，可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性狀態(tài)[4，9]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外周傷害性信號(hào)持續(xù)傳向脊髓時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞能有效地感受傷害性刺激信號(hào)而被激活[10]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞分泌NO、IL-1β等多種物質(zhì)，并誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活躍。上述2種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化后都能釋放大量炎性因子及興奮性氨基酸，通過(guò)MAPK途徑參與慢性疼痛中樞敏化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[11]。神經(jīng)病理性疼痛、CRPSⅠ型疼痛大鼠實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，脊髓背角的GFAP和OX-42表達(dá)均顯著增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與痛覺(jué)信息的整合與調(diào)控[12]。

本實(shí)驗(yàn)MTrPs激活部位在大鼠股內(nèi)側(cè)肌，主要由L4～6脊髓節(jié)段支配，故本實(shí)驗(yàn)以該節(jié)段為取材部位，觀察該節(jié)段GFAP和OX-42蛋白表達(dá)變化。病理和自發(fā)電活動(dòng)是MTrPs激活檢測(cè)的客觀指標(biāo)[13]。本實(shí)驗(yàn)中模型組病理切片可見(jiàn)多個(gè)大小不等的增大、圓染的肌細(xì)胞，增大肌細(xì)胞的周?chē)喑霈F(xiàn)相對(duì)較小的圓形或橢圓形肌細(xì)胞，肌電圖儀記錄到MPS大鼠出現(xiàn)自發(fā)電位，與前人研究[14]結(jié)果一致，說(shuō)明MTrPs處于激活狀態(tài)。經(jīng)電針治療后，MTrPs處肌組織接近正常組肌組織形態(tài)，自發(fā)電位頻率降低，這說(shuō)明電針能改善MPS大鼠肌組織形態(tài)，減少自發(fā)電活動(dòng)，有效滅活MTrPs。與正常組比較，模型組大鼠L4～6脊髓GFAP和OX-42陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化，參與了MPS大鼠中樞敏化反應(yīng)；經(jīng)電針治療后，MPS大鼠脊髓背角的GFAP和OX-42表達(dá)降低，說(shuō)明電針MTrPs能抑制慢性MPS大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。

綜上得出：電針能有效滅活慢性MPS大鼠激痛點(diǎn)，其機(jī)制或與調(diào)節(jié)中樞敏化反應(yīng)，抑制脊髓背角GFAP、OX-42陽(yáng)性細(xì)胞過(guò)表達(dá)有關(guān)。