劉潺，陳杰，李亞峰，閆保娟，張靜

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院輸血科，江蘇南京 210008

腦梗死（cerebral infarction）是由腦缺血缺氧引起的腦組織壞死，尤其高發(fā)于老年人群。隨著人口老齡化問題越來越嚴(yán)峻，老年腦梗死患者數(shù)量也逐漸增加［1-2］。腦梗死后80%以上的患者會(huì)因神經(jīng)功能受損而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙和心境障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［3］。阿司匹林、氯吡格雷是治療腦梗死主要的抗血小板聚集藥物，但研究證實(shí)抗血小板藥物氯吡格雷與阿司匹林抵抗與腦梗死的病情發(fā)展密切相關(guān)，這類藥物不僅影響急性腦梗死的治療效果，而且影響預(yù)后，對(duì)患者康復(fù)帶來諸多不良作用［4］。可采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者是否存在藥物抵抗，如檢測(cè)基因多態(tài)性分析確定患者體內(nèi)代謝抗血小板藥物的速度，檢測(cè)用藥前后血小板功能判斷藥物干預(yù)后的血小板活性，為患者提供臨床用藥指導(dǎo)［5］。臨床常用的血小板功能檢測(cè)方法有血小板功能分析儀法（platelet function analyzer，PFA）、透射光法血小板聚集實(shí)驗(yàn)（light transmittance aggregometry，LTA）和血栓彈力圖（thromboelastography，TEG）［6］。INNOVANCE PFA-200?（PFA-200）血小板功能分析儀是近年來國(guó)內(nèi)新引進(jìn)的血小板功能床旁檢測(cè)分析儀，在PFA-100 的基礎(chǔ)上增加了P2Y（PFA-200P2Y）模塊。本研究選擇139 例老年腦梗死患者，同時(shí)采用PFA-200 P2Y、LTA 和TEG 進(jìn)行檢測(cè)，以進(jìn)一步探討PFA-200 P2Y 的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1．1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，本研究選取2018年3月—2019年8月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為腦梗死的老年患者，共139 例。所有患者在住院后服用氯吡格雷片［賽諾菲（杭州）制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20180029，75 mg×7 s］7 d，聯(lián)合服用阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20171021，100 mg×30 s）3 d。139 例患者中，男性92例，女性47 例，年齡60 ～89 歲，平均年齡（71.4 ±7.6）歲。CYP2C19 基因多態(tài)性檢測(cè)的藥物代謝表型：超快代謝型1 例，占比0.72%；快代謝型48 例，占比34.53%；中間代謝型70 例，占比50.36%；慢代謝型20 例，占比14.39%。將超快代謝型與快代謝型合并為快代謝組，中間代謝型為中等代謝組，慢性代謝型為慢代謝組。3 組患者在性別構(gòu)成、年齡間，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有較好地可比性。見表1。

表1 3 組患者一般資料

1．2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)CT 與顱超聲確診為腦梗死患者［7］；（2）患者年齡≥60 歲；（3）血小板計(jì)數(shù)＞60 ×109／L，Hb ＞70 g／L；（4）具有完整的言語表達(dá)能力，意識(shí)功能清晰；（5）均簽署知情同意書。符合以上全部標(biāo)準(zhǔn)的病例納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在藥物（阿司匹林或氯吡格雷）禁忌癥；（2）嚴(yán)重血液病，或有出血傾向者；（3）重肝腎功能不全；（4）服用其他抗血小板藥物，如西洛他唑、替格瑞洛、華法林等。具備以上任意1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的病例，不納入本研究。

1．3 檢測(cè)方法

139 例老年患者在氯吡格雷片滿7 d，阿司匹林滿3 d后，于早晨空腹采集肘靜脈血4 管。其中3 管以3.2%枸櫞酸鹽抗凝血，于室溫下存放并在4 h 內(nèi)完成檢測(cè)PFAP2Y、 TEG 以及LTA 檢測(cè)。1 管EDTA 抗凝血，存儲(chǔ)在-20 ℃冰箱，待進(jìn)行CYP2C19 基因多態(tài)性檢測(cè)。

1．3．1 CYP2C19 基因多態(tài)性 用CYP2C19 基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)，依次進(jìn)行DNA 提取、 PCR 擴(kuò)增、芯片雜交顯色、芯片色斑信號(hào)放大、掃描及判讀結(jié)果，同時(shí)設(shè)陽性及陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制，各操作步驟謹(jǐn)遵儀器及試劑盒說明進(jìn)行。儀器及試劑盒來自上海百傲科技有限公司。

1．3．2 PFA-200 P2Y 法 采用德國(guó)SIEMENS 公司的PFA-200 血小板功能分析儀與相關(guān)配套試劑盒，測(cè)出數(shù)值＞300 s 時(shí)，儀器上將會(huì)顯示“non-closure”，將此結(jié)果記錄為“300 s”，以試劑盒的臨界值106 s 作為CT 值的標(biāo)準(zhǔn)限，低于106 s 說明血小板功能呈高反應(yīng)性［8］。

1．3．3 LTA 法 采用海倫娜公司AggRAM 血小板聚集分析儀進(jìn)行檢測(cè)。1 000 r／min 離心5 min 先獲得富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），3 500 r／min離心8 min 后又獲得乏血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），以PPP 當(dāng)作對(duì)照，加入5 μL 1 mmol／L ADP 至PRP 中誘導(dǎo)血小板聚集，透光度改變達(dá)到最大時(shí)，記作最大血小板聚集率（MARADP），當(dāng)其＞50%被定義抗血小板耐藥，出現(xiàn)耐藥反應(yīng)，此時(shí)血小板功能呈高反應(yīng)［9］。

1．3．4 TEG 法 使用美國(guó)Haemoscope 公司的TEG 分析儀（TEG ?5000）與相關(guān)配套試劑，以ADP為激活物測(cè)定A 通道、CK 通道、ADP 通道，計(jì)算血小板抑制率，血小板抑制率（IPAADP）：20%～50%表示藥物效果不明顯，51%～75%表示起效，＞75%表示藥物效果明顯，＜50%時(shí)血小板功能呈高反應(yīng)［10］。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，正態(tài)分布時(shí)使用單因素方差分析在組間進(jìn)行比較，非正態(tài)分布時(shí)使用秩和檢驗(yàn)在組間進(jìn)行比較；計(jì)數(shù)資料以例和百分率描述，使用χ2檢驗(yàn)在組間進(jìn)行比較。指標(biāo)間相關(guān)性使用Spearman 相關(guān)分析。檢測(cè)方法的一致性比較使用Cohen's kappa 檢驗(yàn)，并以ROC 曲線評(píng)價(jià)方法的監(jiān)測(cè)價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 3 組患者不同檢測(cè)方法的血小板功能反應(yīng)狀態(tài)

不同代謝組PFA-200 P2Y、 LTA 和TEG 方法測(cè)得CT 值、 MARADP與IPAADP的結(jié)果均有不同。PFA-200 P2Y 法在快代謝組、中等代謝組與慢代謝組平均值分別為206.84s、192.43s 和180.45s；LTA 法在快代謝組、中等代謝組與慢代謝組平均值分別為57.55%、57.86%和69.80%； TEG 法在快代謝組、中等代謝組與慢代謝組平均值分別為64.23%、61.58%和56.02%。根據(jù)CT 值、 MARADP與IPAADP結(jié)果劃分是否為高反應(yīng)狀態(tài)。見表2。

表2 3 組患者不同檢測(cè)方法的血小板功能

3 種方法中LTA 方法在不同代謝組間的高反應(yīng)狀態(tài)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示LTA 的檢測(cè)結(jié)果受到藥物代謝表型的影響最大。見表3。

表3 3 組患者不同檢測(cè)方法的血小板功能高反應(yīng)狀態(tài)比較［例（%）］

2．2 3 種檢測(cè)方法間的相關(guān)性分析

PFA-200 P2Y 與LTA 方法相比較呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），在快代謝組中相關(guān)性最高，在慢代謝組中相關(guān)性最低；在PFA-200 P2Y 與TEG 方法，LTA 與TEG 方法的兩次比較中，均發(fā)現(xiàn)慢代謝組中呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），其中，快代謝組均呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），且相關(guān)性最高；相關(guān)性結(jié)果展現(xiàn)了PFA-200 P2Y 與LTA 方法的良好正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了TEG 與其他兩種方法相比，慢代謝組中出現(xiàn)了負(fù)相關(guān)這一不同的結(jié)果。見表4。

表4 3 種檢測(cè)方法的相關(guān)性

2．3 3 種檢測(cè)方法的一致性

PFA-200 P2Y 與LTA 方法的一致性在快代謝組與中等代謝組較好（P＜0.05），慢代謝組中較差（P＞0.05）。在PFA-200 P2Y 與TEG 方法，LTA 與TEG方法的兩次比較中，除P2Y 與TEG 方法在快代謝組相比較時(shí)一致性較好（P＜0.05），均發(fā)現(xiàn)慢代謝組中的不同結(jié)果。見表5。

表5 3 種檢測(cè)方法的一致性

2．4 3 種檢測(cè)方法的監(jiān)測(cè)價(jià)值

以LTA 法的MARADP ＞50%作為判斷PFA-200 P2Y 與TEG 方法的參考依據(jù)［11］。在快代謝組中，PFA-200 P2Y 的曲線下面積為0.369（P= 0.126），TEG 的曲線下面積為0.286（P=0.012）；在中等代謝組中，PFA-200 P2Y 的曲線下面積為0.387（P=0.111），TEG 的曲線下面積為0.304（P=0.006）；在慢代謝組中，PFA-200 P2Y 的曲線下面積為0.816（P=0.298），TEG的曲線下面積為0.237（P=0.386）；合計(jì)分析，PFA-200 P2Y 的曲線下面積為0.391（P=0.001），TEG 的曲線下面積為0.298（P=0.035）。提示PFA-200 P2Y 方法的監(jiān)測(cè)價(jià)值總體上高于TEG 方法。見圖1。

圖1 PFA-200 P2Y 與TEG 檢測(cè)方法的ROC 曲線圖

3 討論

氯吡格雷與阿司匹林是臨床常用的腦梗死治療藥物，服藥后，患者殘留的血小板反應(yīng)性差別較大［12］。血小板具有粘附、聚集與釋放等眾多功能，人體受傷或由各種因素導(dǎo)致血管破損時(shí)，大量血小板會(huì)立即聚集在血管破損處，聚集成團(tuán)，堵在血管裂口處，同時(shí)還會(huì)釋放出使血管收縮、血液凝固的物質(zhì)，從而防止血液從破損處流出［13］。大量研究證實(shí)血小板水平與腦梗死之間不可忽視的密切關(guān)系，血小板不僅高反應(yīng)性可能導(dǎo)致血栓事件，低反應(yīng)性也可能導(dǎo)致出血危險(xiǎn)，因此，臨床上對(duì)抗血小板藥物治療的監(jiān)測(cè)顯得尤為關(guān)鍵［10，14］。老年腦梗死患者在服用氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林治療后，同時(shí)采用PFA-200 P2Y、 LTA 和TEG 共3 種方法進(jìn)行檢測(cè)，以探討PFA-200 P2Y 在監(jiān)測(cè)抗血小板藥物中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

CYP2C19 基因型可判斷患者攜帶的氯吡格雷代謝相關(guān)的等位基因的類型，從而提示肝臟氯吡格雷藥物代謝速度的分型。本研究根據(jù)CYP2C19 基因型分不同代謝組，觀察PFA-200 P2Y、 LTA 與TEG 方法測(cè)得CT值、 MARADP 與IPAADP 的結(jié)果，3 種檢測(cè)方法在快代謝組、中等代謝組與慢代謝組中的平均值雖然都有一定變化趨勢(shì)，但在反應(yīng)狀態(tài)中，僅LTA 方法發(fā)現(xiàn)不同代謝組間的高反應(yīng)狀態(tài)差異顯著（P＜0.05）。有研究表示CYP2C19 基因型不僅與LTA 測(cè)得血小板反應(yīng)性有關(guān)，還與PFA 法也有關(guān)［12］。雖然與本研究的結(jié)果存在一定的差異，但都能夠證明LTA 的結(jié)果會(huì)受到藥物代謝表型的影響。PFA-200 P2Y 與LTA 方法的相關(guān)性與一致性，優(yōu)于PFA-200 P2Y 與TEG 方法，也優(yōu)于LTA 與TEG 方法的比較?？赡苁怯捎赥EG 的檢測(cè)結(jié)果，不僅受到性別、年齡、血小板計(jì)數(shù)、血脂等諸多因素的因素，其本身精密度比較差，對(duì)個(gè)體的測(cè)量結(jié)果差異比較大，波動(dòng)范圍廣［14-16］。從而致使PFA-200 P2Y 與TEG、LTA 與TEG 方法間的相關(guān)性與一致性較差。氯吡格雷的抗血小板聚集作用在慢代謝患者中，呈現(xiàn)出劑量依賴性，臨床上雙倍劑量的氯吡格雷可有效降低血小板抑制程度，但有些患者4 倍劑量抑制程度仍較低［18］?；蛟S影響了檢測(cè)方法在慢代謝組中的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性。PFA能夠模擬血管損傷時(shí)，血小板在高剪切流的作用下粘附到膜上，與膜和溶解試劑相互作用，激活并釋放出顆粒物質(zhì)，使血流逐漸減少并最終被阻斷的過程［8］。在以LTA 法 的MARADP＞50% 作為參考依據(jù)時(shí)，PFA-200 P2Y 的曲線下面積0.391，高于TEG 的曲線下面積0.298，PFA-200 P2Y 方法的監(jiān)測(cè)價(jià)值與TEG比較高，且在不同代謝組中的結(jié)果較為穩(wěn)定。本研究也存在著樣本量不充足，未對(duì)慢代謝組患者進(jìn)行深入驗(yàn)證的問題，將在以后的研究中改正這些不足之處。

綜上所述，PFA-200 P2Y 與LTA 的一致性與相關(guān)性較優(yōu)，與TEG 的一致性與相關(guān)性較差，但與TEG 比較監(jiān)測(cè)價(jià)值較高。PFA-200 P2Y 具備檢測(cè)所需樣本量少、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、人員培訓(xùn)容易、無需繁瑣的檢驗(yàn)前樣本準(zhǔn)備等優(yōu)點(diǎn)，或可用于監(jiān)測(cè)老年腦梗死患者服用氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林中，對(duì)抗血小板藥物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。