倪曉琛 李佳楠 郭維維 陳偉 楊仕明

1解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部(北京 100853)

2國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心(北京 100853)

3聾病教育部重點實驗室(北京 100853)

4聾病防治北京市重點實驗室(北京 100853)

Waardenburg綜合征（waardenburg syndrome，WS）是一種以聽力-色素異常為特征的綜合征性疾病，遺傳方式以顯性遺傳為主，臨床特征具有明顯異質(zhì)性。其中以虹膜異色、前額白發(fā)、感音神經(jīng)性聾、以及內(nèi)眥異位為主要臨床特征。WS患者可以出現(xiàn)不同程度的感音神經(jīng)性聾，約占WS患者的90.2%[1]。同時約占遺傳性聾病人的2-5%，發(fā)病率為1/42000。WS還可以表現(xiàn)出不同程度不同部位的色素異常，包括虹膜顏色，頭發(fā)，面部以及全身皮膚。依據(jù)患者不同的臨床表現(xiàn)。進一步將WS分為4型，具體見表1。1型WS以內(nèi)眥異位為主要臨床特征，而2型WS不伴有內(nèi)眥異位。3型WS在1型的臨床特征基礎上，還伴有上肢骨骼異常，而4型則在2型的基礎上伴有先天性巨結(jié)腸[2]。WS2具有極為復雜的致病基因基礎，目前仍有部分WS2患者尚未明確致病基因。同樣，WS2中感音神經(jīng)性聾的發(fā)生率高達91.6%，其中以MITF為致病基因的患者發(fā)生率為89.6%[1]。同時目前已經(jīng)報道的相關MITF致病性突變位點已經(jīng)超過50個(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=156845[MIM])，并且多以無義突變?yōu)橹鳌?/p>

表1 表型特征Table 1 Characteristic of phenotype

1 方法

本研究中納入的家系WS20211025，共計四代19人。

1.1 臨床評估

對于家系中成員進行臨床評估，完整收集相關臨床表型。重點關注全身皮膚色素改變情況、雙眼虹膜顏色，頭發(fā)顏色改變等相關色素異常的臨床特征。同時進行眼科相關評估、消化系統(tǒng)相關評估以及體格檢查、骨骼系統(tǒng)相關評估以及檢查，對于可以配合進行純音測聽的成員進行純音測聽檢查，對于無法配合的成員行客觀聽力檢查，包括聽性腦干反應閾值，聽性腦干反應潛伏期，40Hz聽覺相關電位，畸變耳聲發(fā)射檢查。相關聽力學檢查均于中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心進行。依據(jù)WHO的聽力下降分級標準進行分級：正常聽力水平＜20dB；輕度聽力損失：≥20 dB且＜35dB；中度聽力損失：≥35 dB且＜50dB；中重度聽力損失：≥50dB且＜65dB；重度聽力損失：≥65dB且＜80dB；極重度聽力損失：≥80dB且＜95dB ；完全聽力損失/全聾≥ 95dB[3]。

1.2 血樣收集以及DNA提取

家系中僅有4人，包括先證者、先證者妹妹、先證者母親以及先證者父親提供外周靜脈血血樣進行DNA提取。經(jīng)簽署知情同意書后，抽取4名家系成員外周靜脈血5ml以進行進一步的DNA提取，并進行全外顯子測序并進行Sanger驗證。

2 結(jié)果

2.1 家系圖繪制

收集家系成員相關臨床表型后，繪制家系圖WS20211025，見圖1。

圖1 家系圖Fig.1 Pedigree of family WS20211025

（其中紅色表示為聽力下降，藍色表示為藍色虹膜，綠色表示為白斑，黃色表示為面部雀斑）

2.2 臨床特征

先證者Ⅳ-1幼時表現(xiàn)為雙眼藍色虹膜，后虹膜色素逐漸增加，目前已為正常棕色虹膜。雙手背側(cè)可見散在脫色素白斑，全身其他部位未見色素異常改變。骨骼四肢未見畸形，消化系統(tǒng)相關檢查未見明顯異常。Ⅳ-2為為先證者妹妹，其雙眼虹膜呈現(xiàn)不對稱性改變，右眼虹膜部分色素缺失，左眼虹膜為正常棕色。全身皮膚未見色素異常改變。骨骼四肢未見畸形，同時消化系統(tǒng)相關檢查均未見明顯異常。Ⅲ-2為先證者母親，體格檢查中雙眼呈現(xiàn)亮藍色虹膜，顏面部可見雀斑，雙手背面皮膚可見大量散在脫色素白斑，余部位皮膚未見明顯色素改變。Ⅱ-4為先證者外祖母，因病逝世。據(jù)家屬描述為存在聽力下降，并且雙眼為藍色虹膜，雙手背面皮膚同樣存在脫色素白斑。I-1為先證者曾外祖母，為聾啞人，詳細臨床表型無法收集。

圖2 家系成員臨床表型Fig.2 Clinical features of family

2.3 聽力學特征

先證者Ⅳ-1：出生后未行常規(guī)聽力篩查，2歲時由于父母發(fā)現(xiàn)患兒對聲音反應較差，言語發(fā)育遲緩，就診于當?shù)蒯t(yī)院行相關聽力檢查，結(jié)果提示雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾（圖3）。DPOAE檢查左耳各頻率未引出有意義的DPOAE，右耳于1kHz引出反應、ABR反應潛伏期Click下雙耳100dB nHL均未引出反應，聽性腦干反應閾值Click下雙耳96dB nHL均未引出反應，40Hz聽覺相關電位左耳120dB HlL未引出反應，右耳閾值110dB nHL。行顳骨CT檢查，內(nèi)耳結(jié)構以及形態(tài)未見異常，雙側(cè)內(nèi)聽道對稱，無擴大。后于4歲行左側(cè)人工耳蝸植入術，術后規(guī)律佩戴人工耳蝸并行于當?shù)乜祻椭行男袨槠?年的康復訓練?，F(xiàn)患者已進入正常小學進行學習，但目前學習水平較同齡兒童差。Ⅳ-2出生后聽力篩查未通過。聲導抗為雙耳As曲線。ABR反應潛伏期Click下雙耳100dB nHL均未引出反應，聽性腦干反應閾值Click下雙耳100dB nHL均未引出反應MRI檢查內(nèi)聽道水成像未見明顯異常。40Hz聽覺相關電位雙耳閾值均為100dB HL。雙側(cè)顳骨CT平掃未見明顯異常。Ⅲ-2自覺聽力呈現(xiàn)波動性改變，于我院行相關聽力學檢測，結(jié)果提示雙耳對稱性低頻聽力下降（圖4）。Ⅱ-4以及I-1經(jīng)由家中成員描述，均存在聽力下降，同時I-1為聾啞人，側(cè)面提示其可能存在重度甚至極重度聽力損失。

圖3 Ⅳ-1聽力學特征Fig.3 Audiogram ofⅣ-1

圖4 Ⅲ-2聽力學特征Fig.4 Audiogram ofⅢ-2

2.4 基因檢測結(jié)果

經(jīng)過全外顯子測序以及Sanger驗證：該家系中致病基因以及突變位點為MITFc.544A＞T（NM_000248.4），突變位點位于MITF-M的exon 5，產(chǎn)生了單堿基突變，最終導致出現(xiàn)了僅可編碼182個氨基酸的截短蛋白。進一步依據(jù)ACMG指南分類，對突變基因進行解讀，并進行致病性分析。該突變位點符合以下特征：1）PVS1：該突變位點出現(xiàn)單堿基替代后，出現(xiàn)了終止密碼子提前，導致編碼出截短蛋白，丟失了重要的功能結(jié)構閾，符合無功能突變；2）PS4：經(jīng)過基因數(shù)據(jù)庫檢索以及正常人群數(shù)據(jù)庫檢索，對比MITF在該位點的突變，發(fā)現(xiàn)并未收錄，進一步于疾病基因數(shù)據(jù)中進行檢索，發(fā)現(xiàn)該突變位點為新發(fā)現(xiàn)的突變位點，尚未收錄至疾病的基因數(shù)據(jù)庫中；3）PP1:在家系中，WS患者均攜帶了該突變，而表型正常成員未攜帶該突變位點，符合共分離現(xiàn)象；4）PP2：在建立的MITF突變數(shù)據(jù)庫中，大多均以無義突變?yōu)橹?，并已明確為致病突變。在本家系中，突變同樣屬于無義突變。依據(jù)以上證據(jù)，明確WS20211025家系中，MITF（c.544A＞T）為其致病性突變，并未收錄至疾病突變數(shù)據(jù)庫中。同時利用MutationTaster[4]進行突變位點分析，具體分析見表2。

表2 致病性分析Table 2 Pathogenicity analysis

3 討論

在本家系中五名成員符合WS疾病診斷標準，五名患者均表現(xiàn)出聽力下降，但聽力下降程度并不相同。同時，五名患者中四名患者可以獲得完整表型信息。四名患者中均表現(xiàn)出虹膜異色，同時三名患者表現(xiàn)出面部雀斑以及手背部皮膚脫色素白斑。并且其中3名成員經(jīng)基因檢測突變基因為MITFc.544A＞T（NM_000248.4）。其編碼的截短蛋白僅包含182個氨基酸。依據(jù)ACMG指南[5]，明確MITFc.544A＞T為家系致病基因。

MITF（microphthalmia-associated transcription factor）作為一種基礎螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構（basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)家族中的轉(zhuǎn)錄因子，其特征性結(jié)構閾bHLHZip在MITF發(fā)揮作用的過程中具有十分重要的作用。bHLH-Zip主要參與蛋白質(zhì)的二聚化，包括同源以及異源二聚化。只有在形成二聚體后才可以與DNA結(jié)合，發(fā)揮功能[6]。在本家系中，突變位于第5號外顯子，編碼產(chǎn)生的截短蛋白失去了其重要的結(jié)構以及功能閾，所以最終出現(xiàn)了單倍體劑量不足[7]，導致疾病的出現(xiàn)。

MITF具有多種亞型，其中以MITF-M高表達于黑色素細胞中。黑色素細胞來源于神經(jīng)嵴細胞的黑色素細胞系。神經(jīng)嵴細胞發(fā)育以及分化的過程中，在轉(zhuǎn)錄因子PAX3、SOX10以及MITF的調(diào)控下進一步分化為黑色素細胞。依據(jù)黑色素細胞對KIT基因的敏感性，可以將其分為兩類[8]，一類為KIT敏感的黑色素細胞，主要分布于皮膚以及虹膜等；另一類為KIT不敏感的黑色素細胞，主要分布于內(nèi)耳的血管紋中，稱之為中間細胞，參與內(nèi)耳血管紋對耳蝸內(nèi)電位的調(diào)節(jié)。當MITF突變后，相關臨床表型的出現(xiàn)則主要與這兩類細胞的功能改變相關。

黑色素細胞在分化過程中遷移至內(nèi)耳血管紋中，形成中間細胞，與邊緣細胞以及基底細胞等其他細胞，共同組成血管紋，維持耳蝸內(nèi)電位的穩(wěn)定。目前研究表明影響血管紋中這三種主要細胞的突變基因可能通過影響耳蝸內(nèi)電位，使得耳蝸內(nèi)電位失衡，進而導致毛細胞凋亡，最終出現(xiàn)聽力損失。尤其中間細胞中的內(nèi)向回收鉀離子通道Kir4.1在耳蝸內(nèi)電位的維持中有著必要的作用。當其編碼基因kcnj10突變時，耳蝸內(nèi)電位消失，進一步驗證了中間細胞的重要作用[9]。在建立的白化榮昌豬（mitf-m突變）模型中進一步證實了mitf在黑色素細胞遷移至血管紋的過程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)E75時，突變型與野生型在耳蝸血管紋的差異開始顯現(xiàn)，并且在P1時，可以觀察到白化型中，血管紋明顯變薄。在進一步的耳蝸電鏡掃描中可以觀察到耳蝸內(nèi)毛細胞出現(xiàn)融合，并且于底回以及中回較為明顯[10]。進一步的轉(zhuǎn)錄組分析中，發(fā)現(xiàn)突變型豬模型中，K+通道相關基因表達明顯下調(diào)[11]。在小鼠血管紋的單細胞測序中則發(fā)現(xiàn)，MITF不僅高表達于中間細胞，同樣高表達于邊緣細胞[12]。在血管紋中，是否只有中間細胞是神經(jīng)嵴細胞來源的，仍需進一步研究[13]。盡管目前研究已經(jīng)證實MITF突變導致的聽力下降可能與中間細胞功能相關，但是對于同一突變而言，可以呈現(xiàn)出不同程度的聽力下降。正如本家系中，3名經(jīng)基因檢測證實存在MITF突變的患者，均表現(xiàn)為聽力下降，但是卻呈現(xiàn)不同程度的聽力下降，尤其先證者母親呈現(xiàn)為雙耳對稱性輕度聽力損失。攜帶相同的基因突變，但是卻呈現(xiàn)出不同程度的聽力損失，這個問題至今仍在探索以及研究中。MITF突變后，在對神經(jīng)嵴細胞分化過程的調(diào)節(jié)中，是否仍有其他重要的調(diào)控機制，或者MITF基因在表達過程中是否可以經(jīng)由其他正向調(diào)節(jié)機制彌補突變帶來的單倍體劑量不足？盡管已有研究證實在WNT/β-catenin可以一定程度彌補劑量不足帶來的影響[14]。但是背后更多的機制仍需進一步探索。

在本家系中，先證者已行單側(cè)人工耳蝸植入，在經(jīng)過了為期5年的康復訓練后，目前CAP以及SIR分別為7、4。同時學習水平稍差于同齡兒童，并且對英語的接受以及理解能力較差。而先證者妹妹在經(jīng)過為期1年的康復訓練后，目前依舊無法表達完整語句，僅僅可表達較為簡單的詞語，目前CAP以及SIR分別為4、2。盡管先證者行人工耳蝸植入年齡為4歲，錯過最佳植入年齡，但經(jīng)過長達5年的康復訓練，并規(guī)律佩戴人工耳蝸后依舊不能獲得令人滿意的康復效果，這不由得令人深思。影響人工耳蝸植入術后效果的因素較多，但其中以突變基因種類[15,16]以及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量[17]較為重要。當突變基因表達局限于內(nèi)耳時，術后康復效果較好，而當基因影響螺旋神經(jīng)節(jié)細胞時，則無法取得較好的效果[18]。那么MITF對聽覺系統(tǒng)的影響是否僅僅局限于血管紋中？在Chen等人的研究中則證實了MITF突變的榮昌豬中出現(xiàn)了螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的衰退[19]。為我們探索MITF突變對聽力的影響提供的新的方向。同時家系中先證者母親的低中頻聽力下降是否與螺旋神經(jīng)節(jié)細胞衰退相關，仍需要長時間的隨訪以及觀察。

家系中成員的皮膚色素異常的改變，尤其面部雀斑這一臨床特征，與目前相關研究相符合。在Wang等人一項包含90例中國WS患者的研究中發(fā)現(xiàn)，WS2型患者中，以MITF突變的患者多表現(xiàn)為面部雀斑，而SOX10突變的患者則未呈現(xiàn)出這一臨床特征[20]。MITF-M在黑色素的合成的過程中有著重要的作用，可以通過調(diào)節(jié)下游基因黑色素生成的相關基因酪氨酸酶（tyrosinase，TYR),酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase-related protein-1 ，TYRP1)，酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase-related protein-2 ，TYRP2)對黑色素的生成進行調(diào)節(jié)[21]。由于黑色素生成過程中，涉及基因復雜，同時皮膚黑色素細胞合成黑色素受到多種因素的影響，包括種族以及紫外線等，故而皮膚色素異常異質(zhì)性的研究更為復雜。

目前有關WS臨床異質(zhì)性原因的研究多局限為PAX以及SOX10[22]。研究表明PAX以及SOX10臨床表型異質(zhì)性以及臨床表現(xiàn)外顯率不同的原因為無義介導的mRNA降解途徑（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）對截短蛋白進行的調(diào)控。無義介導的mRNA降解途徑是一種高度保守的mRNA質(zhì)量以及數(shù)量監(jiān)控機制[23]，在解釋單基因遺傳性疾病的表型調(diào)控以及生物化學途徑、致病機制的研究中具有重要作用。在SOX10突變導致的疾病中，NMD途徑則有著重要的調(diào)控作用。當截短蛋白逃逸NMD途徑識別時，截短蛋白則以負性效應為主，導致疾病表型作為嚴重的PCWH綜合征（peripheral demyelinating neuropathy,central dysmyelination,Waardenburg syndrome,and Hirschsprung disease，PCWH）[24]。當無義突變出現(xiàn)在基因開放閱讀框編碼區(qū)的早期時，則可以降低突變基因的負性效應并且降低表型的外顯率，尤其以單倍體劑量不足為致病機制的基因中，NMD的調(diào)控作用可以部分解釋臨床表型的異質(zhì)性。而但目前有關MITF的相關研究尚未進行明確報道。MITF是否也受到NMD機制的調(diào)控，從而影響疾病的表型，仍需更多的研究。