邱小兵黃俊高陳俊坤李良玉

1贛州市婦幼保健院(贛州 341000)

2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部(北京 100853)

先天性耳聾是影響嬰幼兒健康和造成殘疾的常見原因，同時也是中國高發(fā)的出生缺陷之一，在每年新增的先天性聽力障礙患兒中，約50%-60%屬于遺傳性耳聾[1，2]。為盡早發(fā)現(xiàn)聽障個體或高危幼兒，及時給予干預(yù)和治療，我國已在臨床逐步推廣新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查，通過對新生兒中耳聾基因突變攜帶者的早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)警，有效預(yù)防和減緩耳聾的發(fā)生發(fā)展。

耳聾基因突變的分布存在一定地區(qū)和人群的差異[3]，目前江西地區(qū)尚未見有大人群的篩查報道，本研究通過高通量測序技術(shù)對贛州市122，635例新生兒進行了大規(guī)模自然人群的耳聾基因熱點突變檢測，有效檢出了先天性耳聾的基因高風(fēng)險患兒并對遲發(fā)性聾及藥物性聾進行了風(fēng)險提示，基于大數(shù)據(jù)明確了贛南地區(qū)的耳聾基因熱點突變和分子流行病學(xué)頻譜，為后續(xù)制定耳聾等相關(guān)出生缺陷的防控策略提供了重要參考和依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2019年4月到2020年9月間，對贛州市及下轄縣區(qū)內(nèi)122，635例新生兒進行耳聾基因檢測，其中85，932例新生兒同時接受了聽力初篩，后續(xù)發(fā)現(xiàn)有聽力異?；蚧蛱崾靖唢L(fēng)險的幼兒臨床建議統(tǒng)一在贛州市婦幼保健院進行聽力診斷與評估。本研究經(jīng)贛州市婦幼保健院倫理委員會批準開展，進行篩查的新生兒監(jiān)護人均簽署知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 聽力篩查

新生兒出生三天后采用耳聲發(fā)射（OAE）進行初次聽力篩查，初篩未通過及漏篩者在出生后29-42天內(nèi)采用OAE聯(lián)合自動聽性腦干反應(yīng)（AABR）檢測進行復(fù)篩，仍未通過者將結(jié)果告知新生兒監(jiān)護人，并要求于3月齡時返院進行聽力診斷。

1.2.2 耳聾基因檢測

新生兒出生3天內(nèi)采集足跟或臍帶血三個血斑，制成干血片封存送往深圳華大基因臨床檢驗中心進行檢測。根據(jù)我國遺傳性耳聾基因熱點突變位點序列信息，設(shè)計特異性擴增引物，利用多重PCR技術(shù)擴增富集人基因組DNA中靶序列并同時引入用于樣本識別的樣本標簽序列。96個樣本的PCR產(chǎn)物將按比例混合成為一個文庫樣本，經(jīng)文庫制備，每個文庫樣本中的DNA序列都加上了用于測序及文庫識別的接頭序列。文庫樣本按等物質(zhì)的量比例混合為一個測序樣本，應(yīng)用華大智造MGIseq500測序儀進行上機測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過文庫接頭序列及樣本標簽序列比對拆分后將被精確定位到每一個樣本中，測序結(jié)果與人類基因組比對，并對20個熱點突變位點進行變異檢測，這些位點包括GJB2基因上的c.35delG、c.176_191del16、c.167delT、c.299_300delAT和c.235delC、GJB3基因上的c.538C＞T和c.547G＞A，SLC26A4基因上的c.281C＞T、c.589G＞A、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.919-2A＞G、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2162C＞T、c.2027T＞A、IVS15+5G＞A和c.2168A＞G和線粒體12SrRNA基因上的m.1555A＞G、m.1494C＞T位點。

1.2.3 聽力診斷及評估

聽力篩查未通過或基因檢測提示高風(fēng)險或后續(xù)自行發(fā)現(xiàn)聽覺異常的幼兒均建議在贛州市婦幼保健院進行聽力診斷。建立患兒病歷，詢問并收集耳聾家族病史。采用聽性腦干反應(yīng)（ABR）、耳聲發(fā)射（OAE）、聲導(dǎo)抗或多頻穩(wěn)態(tài)等檢測方法對患兒進行針對性或聯(lián)合檢測。聽力損失分級標準依據(jù)WHO1997年（日內(nèi)瓦）推薦的聽力減退分級標準。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)一錄入EXCEL表進行處理統(tǒng)計，計數(shù)資料以百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 122，635例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析

共完成122，635例新生兒耳聾基因篩查，檢出突變攜帶者5066例，陽性率為4.13%（5066/12，2635）。GJB2基因突變新生兒2497例（49.29%,2497/5066），其中雜合突變2485例，純合突變9例（c.235delC），復(fù)合雜合突變3例；GJB3基因突變新生兒304例（6.00%，304/5066），全部為雜合突變；SLC26A4基因突變1862例（36.75%，1862/5066），其中雜合突變1837例，純合突變3例（c.919-2A＞G），復(fù)合雜合突變22例；線粒體12SrRNA基因突變332例（6.55%，332/5066），同質(zhì)性突變259例，異質(zhì)性突變73例。此外，本次篩查還檢出雙基因突變70例，其中69例為雙基因雜合突變，還有一例同時攜帶有GJB2基因純合突變（c.235delC）和SLC26A4基因雜合突變（c.919-2A＞G）。具體突變位點、例數(shù)及攜帶率見表1及表2。

表1 5066例陽性檢出者中單基因突變結(jié)果Table 1 The mutations of 5066 positively detected newborns within single gene

表2 5066例陽性檢出者中多基因突變結(jié)果Table 2 The mutations of 5066 positively detected newborns within multiple genes

2.2 新生兒聽力初篩聯(lián)合基因檢測結(jié)果

在122，635例接受耳聾基因檢測的新生兒中，共有85，932例可獲得聽力初篩結(jié)果，其中80，184例新生兒通過了聽力初篩，初篩通過率為93.31%(80184/85932)。在通過聽力初篩的新生兒中,發(fā)現(xiàn)耳聾基因純合突變兒6例（4例c.235delC/c.235delC，2例c.919-2A＞G/c.919-2A＞G），復(fù)合雜合突變兒15例（12例c.1229C＞T/c.1975G＞C；1例c.176_191del16/c.235delC；1例 c.919-2A＞G/c.1226G＞A；1例c.919-2A＞G/1229C＞T），線粒體基因12SrRNA突變349例。

2.3 確診聽力損失患兒的耳聾基因檢測及聽力初篩結(jié)果

項目開展及后續(xù)隨訪期間，在贛州市婦幼保健院進行聽力學(xué)診斷的幼兒中，共有44例確診聽障患兒（35例為單耳或雙耳感音神經(jīng)性聽力損失）可追溯到基因檢測結(jié)果，共檢出15例突變攜帶者（13例確診單耳或雙耳感音神經(jīng)性聽力損失），陽性率為34.1%（15/44），其中GJB2基因純合突變3例，GJB2基因復(fù)合雜合突變2例，SLC26A4基因復(fù)合雜合突變2例，其他單基因雜合突變攜帶者8例。在這44例確診聽力損失的患兒中，共有25例同時追溯到了耳聾基因檢測及聽力初篩結(jié)果，其中有8例患兒通過了聽力初篩，在這8例患兒中有1例中/重度（SLC26A4復(fù)合雜合突變）和1例極重度（GJB2純合突變）聽力損失患兒，均為雙耳感音神經(jīng)性聽力損失。此外，在19例未作聽力篩查的確診患兒中檢出2例GJB2基因純合突變，1例SLC26A4基因復(fù)合雜合突變，5例單基因雜合突變。具體耳聾基因檢測和診斷結(jié)果見表3。

表3 確診聽力損失患兒的耳聾基因檢測及聽力診斷結(jié)果Table 3 The genotype and hearing diagnosis of patients

上接表3

3 討論

我國每年約有3萬名耳聾患兒出生，其中由先天性基因缺陷導(dǎo)致的不在少數(shù)，同時很多遲發(fā)性聽力下降患者或后天用藥致聾個體也都被認為與基因多態(tài)性或易感性有關(guān)，現(xiàn)有研究顯示，有50-65%的耳聾發(fā)病與遺傳因素相關(guān)，其中約70%為非綜合征型耳聾，不伴有其他臨床表型[2,3]。新生兒聽力篩查聯(lián)合基因檢測在耳聾出生缺陷防控中具有重要意義，不僅可以提示遲發(fā)性及藥物性耳聾的基因高風(fēng)險患兒，還可以補充檢出或預(yù)警聽力篩查中漏檢的部分先天性耳聾患兒[4]。王秋菊等人[5]在2007年即提出了新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的理念，目前聯(lián)合篩查已在國內(nèi)廣泛開展。

基于本文中大規(guī)模的人群普篩結(jié)果看，贛南地區(qū)新生兒耳聾基因攜帶率為4.13%，總體攜帶率與此前南昌地區(qū)所報數(shù)據(jù)基本一致（4.05%）[6]，并接近于其他文獻報道的4.17-5.15%[7-14]。聽力篩查中，共可采集到85，932例初篩結(jié)果數(shù)據(jù)，與耳聾基因篩查人數(shù)相比，有3萬余例新生兒的聽力初篩結(jié)果未獲得，復(fù)篩結(jié)果均為手寫記錄于相關(guān)醫(yī)療機構(gòu)中，難以電子化進行數(shù)據(jù)的快速整理與統(tǒng)計，這些在一定程度上表明聽力篩查工作在我國基層地區(qū)的開展需要進一步推廣落實，并需加強醫(yī)療衛(wèi)生數(shù)據(jù)的電子化和可追溯性。在已有的8萬余例聽力初篩結(jié)果中，初篩陽性率為6.69%，與其他研究相比數(shù)據(jù)接近[6,8,10,14]。

本研究中檢測到的耳聾基因突變主要發(fā)生在GJB2和SLC26A4基因上，攜帶率分別為2.04%和1.52%，與南昌地區(qū)所報數(shù)據(jù)略有差異（分別為2.63%和1.01%）[6]。其中GJB2基因在本研究中檢測到的前二熱點突變?yōu)?35delC:雜合突變和299_300delAT:雜合突變，合計占到了該基因陽性結(jié)果中的97.4%，此外還檢測出了9例純合突變和3例復(fù)合雜合突變。其中最熱點的突變?yōu)?35delC突變，在聽力正常人群中攜帶率為1%～2%[15,16]。GJB2基因純合突變或復(fù)合雜合突變有較大概率導(dǎo)致先天性重度耳聾[16]。結(jié)合后期的耳聾患兒聽力診斷結(jié)果，共有3例235delC純合突變和2例GJB2基因復(fù)合雜合突變個體被確診為耳聾患兒，其中2例純合突變均為雙耳極重度聽力損失，1例純合突變和2例復(fù)合雜合突變?yōu)橹?重度聽力損失。

SLC26A4基因在本研究中檢測到的前二熱點突變?yōu)閏.919-2A＞G雜合突變和1229C＞T雜合突變，合計占到該基因陽性結(jié)果中的83.7%，此外還檢測出了3例純合突變和22例復(fù)合雜合突變。SLC26A4基因突變是引起感音神經(jīng)性聾的主要遺傳學(xué)病因之一，一般表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳。該類基因突變致聾的患兒在成長過程中，可能因頭部運動、外力作用、巨大聲音等物理因素而誘發(fā)耳聾[17]。結(jié)合同期的耳聾患兒聽力診斷結(jié)果，共有2例SLC26A4基因復(fù)合雜合突變個體被確診為耳聾患兒，分別為重度/極重度聽力損失和中/重度聽力損失。

線粒體12SrRNA基因與氨基糖苷類藥物引起的藥物耳聾密切相關(guān)。本研究共檢測出線粒體基因突變共332例，突變攜帶率為0.27%，落于國內(nèi)外相關(guān)研究中報道的0.224%～0.345%的區(qū)間內(nèi)，與此前有關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)的江西地區(qū)線粒體突變攜帶率較高的結(jié)果（0.38%）不一致[6]，這可能與檢測的群體規(guī)模以及更細微的地區(qū)差異性有關(guān)。GJB3基因最初被發(fā)現(xiàn)在中國患者中導(dǎo)致常染色體顯性遺傳非綜合征型聾,被認為與遲發(fā)性耳聾相關(guān)[9]。在本次同期確診耳聾的幼兒中，未發(fā)現(xiàn)線粒體基因及GJB3基因的突變案例。

綜上，GJB2和SLC26A4基因的純合致病突變發(fā)生率雖然較低，但是一旦發(fā)生很大可能引起新生兒的語前聾，且多為感音性耳聾，聽力損失程度常為重度甚至極重度。因此在地區(qū)/城市級別的大人群耳聾基因篩查中，一旦發(fā)現(xiàn)這兩個基因的純合突變，相關(guān)醫(yī)院、檢測機構(gòu)及有關(guān)政府部門一定要給予足夠重視，建立起完善的轉(zhuǎn)診干預(yù)機制，對這類患兒及時進行干預(yù)治療。另外本研究結(jié)果顯示，SLC26A4基因上的復(fù)合雜合突變相比于純合突變更高發(fā)，也需引起臨床及監(jiān)管機構(gòu)的重視，不過該類突變的致病表型存在更高的異質(zhì)性，遺傳解讀相對復(fù)雜，相關(guān)篩查及診斷醫(yī)院應(yīng)與檢測機構(gòu)保持密切合作，為耳聾基因復(fù)合雜合突變兒提供更詳盡的后續(xù)隨訪及遺傳咨詢[18]。

值得注意的是，項目開展期間在我院進行聽力學(xué)診斷的幼兒中，共有25例確診聽力損失的患兒可同時追溯到聽力初篩和耳聾基因檢測結(jié)果，其中有8例患兒通過了聽力初篩。在這8例患兒中有2例中/重度和極重度聽力損失患兒在此前的耳聾基因檢測中已被發(fā)現(xiàn)分別為GJB2基因的復(fù)合雜合突變和純合突變，并以此為指征進行了聽力診斷。另外本項目中還發(fā)現(xiàn)了3例未做聽力篩查但經(jīng)耳聾基因檢測提示為高風(fēng)險的個體，在最后的聽力診斷中被確診為中度到極重度的聽力損失。這些案例充分說明了耳聾基因檢測對于新生兒聽力篩查的必要性和互補性，在成為一線篩查手段后能發(fā)現(xiàn)部分因為各種因素在聽力篩查中漏檢的先天性耳聾患兒，使其早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早治療成為可能，對提升人口素質(zhì)、減少社會負擔(dān)具有重要意義。