邢銀英，陳 建，張碧宇，顏艷陽，林 飛，項(xiàng)林敏，邵曉林，周建峰

（溫州市質(zhì)量技術(shù)檢測科學(xué)研究院，浙江溫州 325000）

0 引言

近年來，農(nóng)業(yè)部下發(fā)《關(guān)于切實(shí)加強(qiáng)蛋禽養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理工作的通知》，要求啟動針對氟蟲腈違法違規(guī)使用的專項(xiàng)檢查[1]，嚴(yán)防氟蟲腈在生產(chǎn)經(jīng)營各環(huán)節(jié)對飼料原料和產(chǎn)品造成污染，所以理論上氟蟲腈不應(yīng)該在蛋及禽源類肉中檢出，也未就此項(xiàng)目禽肉及其制品進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)控[2]。目前，我國氟蟲腈的檢測主要在植物源性產(chǎn)品、飼料產(chǎn)品及蛋類產(chǎn)品[1，3-10]，而國家監(jiān)督抽檢中并不包括禽源類肉及其肉制品的氟蟲腈限量，既然氟蟲腈在雞蛋中的存在已是事實(shí)，有必要對其上游產(chǎn)業(yè)鏈的禽源類肉及其肉制品進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)控。雖然我國內(nèi)地市場沒有歐洲“毒雞蛋”流入[2]，但是蛋類上游鏈端的禽源類肉及其肉制品可能已經(jīng)以進(jìn)口方式進(jìn)入我國市場。

在現(xiàn)有的氟蟲腈檢測方法中，定性定量的主要方法有氣相色譜法[8]、液相色譜法[5，7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6，10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4，9，11-20]等，這些方法中常用的前處理方法有液-液萃取[9]，固相萃取[19]（SPE），較為費(fèi)時費(fèi)力，同時產(chǎn)生較多的有機(jī)溶劑污染。國內(nèi)針對于氟蟲腈及其代謝物的行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)有GB 23200.115—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》、GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》等（該標(biāo)準(zhǔn)只對氟蟲腈本體做測定），但是這些標(biāo)準(zhǔn)并沒有覆蓋到大部分禽源類肉和肉制品。經(jīng)查閱，文獻(xiàn)中有較多提到利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行測定，王永芳等人[3]利用LC-MS/MS 測定雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲腈及代謝物殘留量。戴盡波等人[4]利用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測禽源性食品中氟蟲腈及其代謝物等。但是，目前以氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，對禽源類肉和肉制品進(jìn)行檢測的研究并未開展，GC-MS/MS 儀器檢測在定量定性上準(zhǔn)確度和精確度都比較高，且方法檢出限穩(wěn)定。

試驗(yàn)采用QuEChERS 前處理方法，建立檢測禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及3 種代謝物殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。通過對于不同禽源類肉及其肉制品及其提取溶劑、凈化方式和色譜分析條件進(jìn)行研究，開發(fā)出一套操作性強(qiáng)、適應(yīng)性和覆蓋面廣、可行性強(qiáng)、效率高，同時精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度均能滿足相關(guān)要求的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均為100 μg/mL 液體標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶于乙腈，上海Anpel 公司提供；甲醇、乙腈（色譜純），上海Anpel 公司提供；氯化鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；凈化管含PSA、C18、無水MgSO4，上海Anpel 公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 8890/7000D 三重四極桿氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，配EI 源，美國Agilent 公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器，德國IKA 公司產(chǎn)品；SIGMA 冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥10 000 r/min），美國Sigma 公司產(chǎn)品；Research Plus微量移液器，德國艾本德公司產(chǎn)品；濾器（0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜），上海Anpel 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1） 混合中間工作液。分別移取200 μL 氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成2.0 μg/mL 的混合溶液。

（2） 臨用時，用空白樣品前處理所得基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.050，0.100，0.200，0.500 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 試樣的制備與保存

將雞肉、鴨肉和鵝肉等禽類樣品各200 g，切碎均質(zhì)混勻，分別裝至潔凈容器內(nèi)作為測試樣，-18 ℃以下保存。

1.3.3 檢測樣品制備

稱取5 g（精確到0.01 g） 樣品，放入50 mL 聚丙烯離心管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的酸化乙腈溶液20 mL，渦旋混合5 min，再加入2 g 氯化鈉，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心5 min，使兩相分層；移取上層乙腈溶液1 mL 于2 mL 聚丙烯凈化離心管中，加入凈化粉末N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、無水MgSO4，渦旋混勻1 min，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后，待測定。

1.3.4 色譜質(zhì)譜條件

毛細(xì)管色譜柱：VF-1701MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；溫度：進(jìn)樣口280 ℃；柱溫100 ℃（40 ℃/min） ～250 ℃（2 min，40 ℃/min） ～280 ℃（6 min）；離子源280 ℃；載氣流速：氦氣，純度≥99.999%，1.0 mL/min；進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，電子轟擊源70 eV，溶劑延遲5 min，進(jìn)樣方式不分流進(jìn)樣，監(jiān)測方式為動態(tài)多重反應(yīng)檢測（DMRM）。

氟蟲腈及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 DMRM 離子對參數(shù)采集圖

DMRM 離子對參數(shù)采集圖見圖1。

圖1 DMRM 離子對參數(shù)采集圖

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過Agilent Masshunter 工作站及定性定量處理系統(tǒng)采集分析質(zhì)譜圖，基質(zhì)配標(biāo)外標(biāo)定量工作曲線，采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)表格和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)過程萃取優(yōu)化

有機(jī)試劑乙腈通用性比較強(qiáng)，對于極性和非極性農(nóng)藥均有較高的提取效果，能溶解大多數(shù)農(nóng)藥，且可溶入的油脂量極少，在許多農(nóng)藥殘留提取試驗(yàn)中都直接用乙腈作為提取溶劑，樣品提取液離心分層后，農(nóng)藥及其相關(guān)代謝組分被分配到有機(jī)相中。擬以加標(biāo)回收率作為指標(biāo)，考查乙腈、乙腈水、酸性乙腈和酸性乙腈水4 種提取試劑的萃取效果，試驗(yàn)過程依據(jù)1.3.3 步驟。

對每種萃取進(jìn)行平行添加試驗(yàn)，后發(fā)現(xiàn)純乙腈的萃取效果優(yōu)于乙腈水，在提取過程中能夠更好地將蛋白成分進(jìn)行沉淀，同時相對于其他試劑，乙腈能夠降低脂肪和其他雜質(zhì)的溶出度。合適酸性范圍的乙腈與純乙腈相比，減少雜質(zhì)成分對目標(biāo)物氟蟲腈及代謝物（氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈） 的干擾性，同時增加其測定響應(yīng)值，綜合比較試驗(yàn)采用0.5%酸性乙腈作為萃取試劑。萃取過程中，加入適量NaCl 鹽析，有助于兩相離心分層，減少有機(jī)相中的水分，且增加中、高極性農(nóng)藥在有機(jī)相中的溶解度。

萃取試劑回收率均值分析圖見圖2。

圖2 萃取試劑回收率均值分析圖

2.2 萃取液凈化組分分析

常用QuEChERs 的凈化劑有N- 丙基乙二胺（PSA），屬于固相吸附劑，與NH2相似，PSA 有2 個氨基PKa 值分別為10.1 和10.9，比氨基柱更強(qiáng)的離子交換能力，廣泛用于植物農(nóng)殘分析樣品的處理，以及去除糖類、脂肪酸和親脂性色素等極性成分。十八烷基硅烷鍵合硅膠C18，含碳量10%，具有疏水作用，對非極性的組分有吸附作用，主要用于反相萃取，適合于非極性到中等極性的化合物。無水MgSO4，是為了去除水分而添加[4，9，11]。由于禽源肉類及其肉制品中存在色素問題較少，對于石墨化炭黑GCB 就不再做考查。試驗(yàn)采用QuEChERS 前處理方法，所以盡可能偏向高效、簡潔、快速方式。

試驗(yàn)針對不同比例的N- 丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、無水MgSO4凈化組分搭配測試，通過同一水平的多組平行添加試驗(yàn)，以回收率作為依據(jù)考查凈化組分的最佳配比。PSA 和C18的作用主要在于吸附雜質(zhì)，而無水MgSO4以除水為主，所以在添加量上會高于前兩者。經(jīng)多種組凈化填料配比進(jìn)行添加試驗(yàn)，方法學(xué)考查，采用無水硫酸鎂150 mg，N-丙基乙二胺50 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠C1850 mg 作為凈化組分。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品基質(zhì)中某些提取物組分對待測物濃度或質(zhì)量測定準(zhǔn)確度的影響，在質(zhì)譜分析上具體可以描述為待測溶液在離子化過程中，非待測物及干擾組分的離子化行為對于待測目標(biāo)物的離子化程度產(chǎn)生的加強(qiáng)效應(yīng)或者抑制效應(yīng)[13-20]。禽源肉類樣品乙腈萃取所得的化學(xué)成分復(fù)雜，含較多的油脂類等大分子物質(zhì)，氣相色譜質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)明顯，為準(zhǔn)確定量目標(biāo)化合物，減少基質(zhì)干擾，采用空白樣品的平行試驗(yàn)基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.4 儀器分析條件選擇

根據(jù)目標(biāo)物氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈的結(jié)構(gòu)分析，比較多種極性的毛細(xì)管色譜柱，采用較適合農(nóng)殘分析的重型惰性化毛細(xì)管柱VF-1701MS 進(jìn)行分析測試，能夠利用串聯(lián)質(zhì)譜的性質(zhì)有效采集目標(biāo)化合物，具體色譜參數(shù)見1.3.4 色譜質(zhì)譜條件。

使用質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，通過全掃描、前級離子掃描、產(chǎn)物離子掃描等采集模式找到相應(yīng)的前級離子和產(chǎn)物離子, 優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，建立MRM 方法。對4 種化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行不同碰撞電壓下的各化合物標(biāo)準(zhǔn)品二級全掃描質(zhì)譜圖。

3 討論與評價

3.1 線性分析

將氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度逐級稀釋至0.005，0.010，0.020，0.050，0.100，0.200，0.500 μg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 種藥物在0.005～0.500 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r） 均大于0.990。

氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3。

圖3 氟蟲腈及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 方法回收添加與精密度

氟蟲腈及其3 種代謝物按0.02，0.05，0.10 mg/kg，3 個質(zhì)量濃度分別添加至空白雞肉、鴨肉和鵝肉樣品中，每個質(zhì)量濃度做6 個平行樣，按方法進(jìn)行樣品處理，基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)正曲線定量，計算回收率與精密度。同時，分別以S/N≥3、S/N≥10 為判斷依據(jù)確定方法的檢出限與定量限。通過對3 類實(shí)際樣品加標(biāo)回收檢測分析，得到加標(biāo)回收率為80.8%～106.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.0%。經(jīng)分析計算，氟蟲腈及其3 種代謝物的定量限均在0.01～0.02 mg/kg。

模擬加標(biāo)水平下的回收率及精密度見表2。

表2 模擬加標(biāo)水平下的回收率及精密度

3.3 實(shí)際樣品分析

從市場上分別抽取20 批次雞肉，20 批次鴨肉，20 批次鵝肉樣品，10 批雞肉制品，10 批鴨肉制品，10 批鵝肉制品，按照指定方法進(jìn)行檢測，均未檢測出陽性樣品。

4 結(jié)論

采用QuEChERS 前處理方法，建立檢測禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及其代謝物3 種藥物殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。通過對于不同禽源類肉及其肉制品及其提取溶劑、凈化方式和色譜分析條件進(jìn)行研究，開發(fā)出一套操作性強(qiáng)、適應(yīng)性和覆蓋面廣、可行性強(qiáng)、效率高，同時其精密度、靈敏度和準(zhǔn)確度能滿足相關(guān)要求的檢測方法。通過該方法能夠?qū)κ袌錾鲜圪u的各種禽源類肉和肉制品做到氟蟲腈及代謝物殘留量的有效控制，改善市場的禽源類肉及其肉制品的安全問題。