張 翠，王繼勝，王 林，胡澤波，張根葆*

（1.皖南醫(yī)學院病理生理學教研室，安徽蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學院）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為導致終末期腎臟疾病的主要因素之一，其發(fā)病機制仍未闡明。在其復雜的機制中，炎癥反應可能占據(jù)重要地位[1]。糖尿病狀態(tài)下，多種炎癥因子被激活，加速DN的發(fā)展。髓系相關(guān)蛋白MRP8（S100A8）是S100家族的一員，多以異源二聚體S100A8/A9的形式發(fā)揮功能。目前，S100A8/A9的研究報道多見于炎癥性疾病及腫瘤方面，而在糖尿病及其并發(fā)癥方面的研究較少[2]。

梓醇是從地黃根部分離提純的一種糖苷，具有降低血糖、抗炎、抗氧化損傷、降血脂等多種作用。已有研究證實，梓醇能延緩糖尿病腎組織結(jié)構(gòu)和功能的早期病變，在一定程度上對DN起到防治作用[3]，但具體機制尚未闡明。本研究通過檢測糖尿病大鼠腎臟S100A8、TLR4、NF-κB蛋白的表達情況及相關(guān)生化指標的改變，探討梓醇對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24只雄性SD大鼠，體重180～210g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司；梓醇購自南京景竹生物科技有限公司；兔抗鼠TLR4抗體、兔抗鼠S100A8抗體、兔抗鼠NF-κB抗體購自安徽奈徹生物科技有限公司；免疫組化試劑盒，HRP山羊抗兔二抗為武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品；血糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，血肌酐、考馬斯亮藍檢測試劑盒均為南京生物建成研究所產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 復制模型 動物適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分出正常對照組大鼠8只，其余大鼠禁食12h后，腹腔注射60mg/kg溶于無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5）的STZ，正常對照組注射等量的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，72h后測空腹血糖，血糖值大于等于16.7 mmol/L的動物視為糖尿病模型復制成功。

1.2.2 大鼠分組 共將大鼠分為3組，除正常對照組大鼠外，將糖尿病模型復制成功的大鼠隨機平均分為2組，即糖尿病模型組和梓醇干預組，每組8只。正常對照組：生理鹽水2ml/d；糖尿病模型組：生理鹽水2ml/d；梓醇干預組：梓醇10mg/kg·d灌胃。

1.2.3 動物標本的收集 各組動物飼養(yǎng)至6周處死，處死前禁食12h，麻醉后腹主動脈穿刺取血，4℃離心取上清，取雙側(cè)腎臟，計算腎重與體重比值，一側(cè)腎臟固定于4%中性甲醛溶液，制作石蠟切片供免疫組織化學及形態(tài)學檢測使用；另一測腎臟于-80℃冰箱保存，供其他生化指標檢測。

1.2.4 大鼠空腹血糖、血肌酐、尿蛋白的檢測 空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測，尿蛋白含量用考馬斯亮藍法測定，血肌酐采用肌氨酸氧化酶法測定。

1.2.5 免疫組織化學檢測 腎組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，用鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶法檢測腎組織S100A8、TLR4、NF-κB活性，以PBS為一抗做陰性對照，DAB染色，蘇木素復染。采用Image-Pro plus 6.0型圖像分析軟件進行分析，每張切片隨機選取5個視野（×400），蛋白表達量以每個視野積分光密度均值表示，越高表示蛋白表達越強。

1.2.6 形態(tài)學檢測 采用HE染色，光鏡觀察大鼠腎組織形態(tài)學改變。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 所有研究數(shù)據(jù)均應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析和處理。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間差異顯著性比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟指數(shù)的比較

糖尿病模型組大鼠逐漸出現(xiàn)“三高一低”的典型表現(xiàn)，體重較正常對照組減輕，腎重體重比值明顯增大，且隨著病程的延長更加明顯；梓醇干預組上述表現(xiàn)有所減輕，且腎重體重比值較模型組明顯下降，見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數(shù)的比較

表1 各組大鼠腎臟指數(shù)的比較

與正常對照組比較，*P＜0.01；與糖尿病模型組比較，#P＜0.01

組別 腎重(g) 體重(g) 腎重/體重(mg/g)正常對照組 2.23±0.16 361.63±19.76 6.18±0.40糖尿病模型組 2.14±0.22 179.63±17.64* 11.95±1.21*梓醇治療組 2.20±0.24 258.88±26.63# 8.50±0.61#

2.2 各組大鼠生化指標的檢測

如表2所示，相比對照組，模型組大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白量明顯增高，而梓醇干預組3個指標均明顯下降。

表2 各組大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白的比較

表2 各組大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白的比較

與正常對照組比較，*P＜0.01；與糖尿病模型組比較，#P＜0.01

組別 血糖（mmol/L） 血肌酐(μmol/L) 24h尿蛋白(mg)正常對照組 5.87±0.99 69.07±10.01 4.17±1.79糖尿病模型組 21.71±3.96* 157.87±23.37* 59.48±15.70*梓醇治療組 15.90±3.53# 117.32±21.21 # 30.45±9.03#

2.3 各組大鼠S100A8、TLR4、NF-κB的表達情況比較

正常對照組大鼠腎組織S100A8、TLR4、NF-κB均有少量表達，糖尿病模型組大鼠腎臟3種蛋白的表達量均明顯增加，而梓醇干預組3者表達量均有所下降，見表3，圖1。

表3 各組腎組織S100A8、TLR4、NF-κB的表達水平比較

圖1 各組S100A8、NF-κB、TLR4蛋白在腎組織中的表達（×400）

2.4 各組腎組織形態(tài)學比較

糖尿病模型組上皮細胞空泡變性，脫落，腎小管擴張，基底膜破壞，腎小球明顯充血。梓醇干預組腎臟基底膜完整，破壞程度較輕，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)接近正常，如圖2。

圖2 各組腎組織形態(tài)比較（HE，×400）

3 討論

DN最基本、最突出的特征之一是腎臟纖維化，而導致腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的主要原因之一就是炎癥，其在DN發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的作用[4,5]。TNF-α、IL-18、IL-1β和MCP-1等促炎因子在DN中特異表達，引發(fā)炎癥瀑布反應，產(chǎn)生大量氧自由基，導致腎臟結(jié)構(gòu)損傷[6,7]。因此，阻斷炎性激活通路可能對防治DN具有重要意義。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，梓醇既能降低糖尿病的血糖水平，又能很好的控制糖尿病并發(fā)癥，但其機制尚未闡明。本研究采用梓醇作為治療藥物，結(jié)果顯示，治療組的空腹血糖明顯減低，腎臟指數(shù)下降，且蛋白尿及血肌酐水平明顯降低，HE染色顯示腎臟損傷亦減輕，說明其對DN具有一定的保護作用。

S100A8蛋白在炎癥條件下表達上調(diào)，已成為新的炎癥介質(zhì)標記物。在應激等因素作用下，炎癥細胞受到S100A8的刺激后，能夠產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)，參與機體炎癥反應調(diào)節(jié)。研究表明，S100A8/A9的濃度隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變程度的加重而增加，提示S100A8/A9濃度可能反映視網(wǎng)膜病變的嚴重程度[8]。有研究顯示，S100A8除了在炎癥過程中起作用外，還可能在DN的病理生理過程中起作用[9]。在DN患者體內(nèi)，蛋白尿的程度與S100A8/A9的水平呈正相關(guān)[10]。國外學者研究認為，STZ誘導的1型糖尿病小鼠腎小球中，S100A8的mRNA表達水平普遍增高[11]，這些均提示S100A8可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展。本實驗觀察了各組大鼠腎臟S100A8蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)病程6周的糖尿病大鼠腎臟S100A8蛋白表達較正常組明顯增多，表明S100A8與DN的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而梓醇干預組S100A8的表達明顯減少，表明梓醇能夠減少S100A8的產(chǎn)生，其機制可能與梓醇的抗炎抗氧化作用有關(guān)。

TLR4/NF-κB通路是介導炎癥反應的關(guān)鍵信號通路，已有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎臟TLR4顯著增多[12]。TLR4能誘導NF-κB活性增加，NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子(包括MCP-1、TNF-α和IL-6)的表達[13]，從而促進DN的進展。本研究亦檢測到糖尿病大鼠腎臟TLR4及NF-κB蛋白表達均顯著增多，說明二者均參與了DN炎癥的發(fā)生發(fā)展進程，梓醇能夠通過抑制二者表達而減輕DN腎臟損害。推測在糖尿病狀態(tài)下，S100A8激活后表達增多，進一步激活TLR4，以促進胞內(nèi)髓樣分化因子轉(zhuǎn)運，使IL-1受體相關(guān)激酶-1活化[14]，進而誘導NF-κB活化[15]，分泌釋放多種炎癥因子，加重DN。

本實驗結(jié)果提示，經(jīng)梓醇治療的糖尿病大鼠血糖降低，腎體比明顯下降，結(jié)合HE染色形態(tài)學觀察，提示梓醇可能通過降低糖尿病腎臟S100A8、TLR4及NF-κB蛋白的表達，進而抑制DN慢性炎癥反應，以減輕糖尿病造成的腎臟損害。