胡萬祥，李金堯，李雨欣，韓思雨，程露陽，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

自噬在2型糖尿病中發(fā)揮著重要作用[1]。在自噬的3種方式（微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和巨自噬）中，巨自噬被認(rèn)為具有保護(hù)胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙的作用[2,3]。同時(shí)，巨自噬可特異性作用于線粒體，通過清除功能障礙的線粒體調(diào)控線粒體的質(zhì)量和功能[4]。當(dāng)前,針對線粒體治療藥物的研究越來越受到重視。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠（蠶繭提取物）有良好的抗糖尿病功效，然而絲膠具有的抗糖尿病功效是否與調(diào)控自噬和線粒體作用有關(guān)尚不明確，對此，本研究進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、培養(yǎng)及分組處置

1.1.1 細(xì)胞 大鼠胰島素瘤細(xì)胞（INS-1細(xì)胞，CL-0368），武漢普諾賽生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)基的構(gòu)成：85% RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+5%雙抗+50μmol/L β-巰基乙醇。培養(yǎng)條件：37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.1.3 INS-1細(xì)胞分組及處置 將INS-1細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組。A組為正常組，將INS-1細(xì)胞按上述條件培養(yǎng)24h；B組為鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致?lián)p傷組，向INS-1細(xì)胞完全培養(yǎng)基中加入含10mmol/L的STZ，培養(yǎng)24h；C組，在B組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入低劑量的絲膠（150μg/mL），培養(yǎng)24h；D組，在B組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入中劑量的絲膠（300μg/mL），培養(yǎng)24h；E組，在B組細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入高劑量的絲膠（600μg/mL），培養(yǎng)24h。

1.2 檢測INS-1細(xì)胞LC3B-II/LC3B-I、SIRT1、ATG5、BECLIN1、PINK1的表達(dá)

1.2.1 蛋白 采用免疫蛋白印跡法。常規(guī)提取INS-1細(xì)胞總蛋白，定量后確定上樣量（30～60μg），SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜（穩(wěn)流200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間30min～2h），脫脂奶粉封閉，一抗室溫孵育2h，二抗室溫孵育1h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影，分別測定指標(biāo)蛋白條帶與相應(yīng)β-actin條帶的灰度值，使用Image J軟件分析二者的比值，作為各指標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。各檢測指標(biāo)的凝膠濃度、封閉奶粉濃度，一抗和二抗稀釋濃度見表1：

表1 各檢測指標(biāo)的凝膠濃度、封閉奶粉濃度，一抗和二抗稀釋濃度

1.2.2 mRNA 按照試劑盒的說明進(jìn)行操作提取樣品的RNA，確定無污染、無降解后逆轉(zhuǎn)為cDNA，擴(kuò)增后進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次，得到各檢測指標(biāo)mRNA表達(dá)的CT值后進(jìn)行定量分析，采用公式2-△△Ct法。各檢測指標(biāo)的引物序列（引物購于上海生工工程有限公司）和擴(kuò)增條件分別見表2，表3：

表2 各檢測指標(biāo)的引物序列和產(chǎn)物大小

檢測指標(biāo) 引物序列（5’-3’） 產(chǎn)物大小BECLIN1 F:TCAAGATCCTGGACCGAGTGACC 85bp R:TCCTGGCTCTCTCCTGGTTTCG PINK1 F:CACGACGCTCAACTTGGCTACTC 137bp R:ACGCACTCCTCGGCACCATAC β-actin F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -R:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG

表3 PCR反應(yīng)程序

1.3 檢測INS-1細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量

采用DCFH-DA ROS熒光探針檢測：INS-1細(xì)胞按照上述條件培養(yǎng)后，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察、拍照，每次選取3個(gè)視野，重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析總的熒光強(qiáng)度，作為ROS含量的相對值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理所得數(shù)據(jù)，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異后的組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以）表示。

2 結(jié)果

2.1 絲膠可提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞LC3B-II/I蛋白和LC3B mRNA的表達(dá)

比較各組INS-1細(xì)胞LC3B-II/I蛋白和LC3B mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯降低（P＜0.05）；C組、D組、E組均較B組明顯升高（P＜0.05），且3組細(xì)胞的表達(dá)水平依次為E組＞D組＞C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖1、圖2。

圖1 各組INS-1細(xì)胞LC3B-II/I蛋白

圖2 各組INS-1細(xì)胞各檢測指標(biāo)mRNA的表達(dá)

表4 各指標(biāo)蛋白和mRNA的表達(dá)（

表4 各指標(biāo)蛋白和mRNA的表達(dá)（

與A組比較：*P＜0.05；與B組比較：#P＜0.05；與C組比較：△P＜0.05；與D組比較：$P＜0.05

組別 LC3B-II/I/LC3B SIRT1 AGT5 BECLIN1 PINK1蛋白A組 7.031±0.686 0.805±0.125 0.425±0.041 0.769±0.093 1.903±0.163 B組 5.374±0.858* 0.498±0.135* 0.314±0.019* 0.598±0.008* 0.982±0.108*C組 7.307±0.374# 0.736±0.136# 0.422±0.019# 0.892±0.034# 1.334±0.124#D組 8.568±0.688#△ 1.030±0.123#△ 0.524±0.057#△ 1.051±0.024#△ 1.702±0.153#△E組 10.766±0.605#△$ 1.287±0.127#△$ 0.634±0.056#△$ 1.187±0.066#△$ 2.080±0.225#△$mRNA A組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 B組 0.756±0.087* 0.753±0.016* 0.667±0.067* 0.700±0.091* 0.729±0.052*C組 1.040±0.092# 1.114±0.093# 1.085±0.060# 1.028±0.049# 1.139±0.185#D組 1.387±0.160#△ 1.456±0.128#△ 1.394±0.049#△ 1.323±0.105#△ 1.509±0.180#△E組 1.667±0.086#△$ 1.738±0.103#△$ 1.782±0.220#△$ 1.625±0.176#△$ 1.894±0.129#△$

2.2 絲膠可提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞SIRT1蛋白和mRNA的表達(dá)

比較各組INS-1細(xì)胞SIRT1蛋白和SIRT1 mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯降低（P＜0.05）；C組、D組、E組均較B組明顯升高（P＜0.05），且3組細(xì)胞的表達(dá)水平依次為E組＞D組＞C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4，圖2，圖3。

圖3 各組INS-1細(xì)胞SIRT1蛋白的表達(dá)

2.3 絲膠可提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞AGT5蛋白和mRNA的表達(dá)

比較各組INS-1細(xì)胞AGT5蛋白和AGT5 mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯降低（P＜0.05）；C組、D組、E組均較B組明顯升高（P＜0.05），且3組細(xì)胞的表達(dá)水平依次為E組＞D組＞C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4，圖2，圖4。

圖4 各組INS-1細(xì)胞AGT5蛋白的表達(dá)

2.4 絲膠可提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞BECLIN1蛋白和mRNA的表達(dá)

比較各組INS-1細(xì)胞BECLIN1蛋白和BECLIN1 mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯降低（P＜0.05）；C組、D組、E組均較B組明顯升高（P＜0.05），且3組細(xì)胞的表達(dá)水平依次為E組＞D組＞C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖2、圖5。

圖5 各組INS-1細(xì)胞BECLIN1蛋白的表達(dá)

2.5 絲膠可提高STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞PINK1蛋白和mRNA的表達(dá)

比較各組INS-1細(xì)胞PINK1蛋白和PINK1 mRNA的表達(dá)：B組較A組明顯降低（P＜0.05）；C組、D組、E組均較B組明顯升高（P＜0.05），且3組細(xì)胞的表達(dá)水平依次為E組＞D組＞C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖2、圖6。

圖6 各組INS-1細(xì)胞PENK1蛋白的表達(dá)

2.6 絲膠可降低STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞ROS的含量

B組INS-1細(xì)胞ROS含量為（5.770±0.724），較A組（1.034±0.035）明顯降低（P＜0.05）。C組（3.622±0.636）、D組（2.385±0.523）、E組（1.652±0.664）INS-1細(xì)胞ROS含量，較B組明顯降低（P＜0.05）；并且，3組細(xì)胞ROS含量依次為E組＜D組＜C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖7：

圖7 各組INS-1細(xì)胞ROS檢測情況（×10）

3 討論

我國自古就對蠶繭的應(yīng)用進(jìn)行了探索，但僅針對蠶繭的組分——絲素。近年來，針對占蠶繭25%左右的絲膠蛋白（也稱絲膠）進(jìn)行了較多研究，發(fā)現(xiàn)絲膠不僅具有良好的生物相容性，還具有抗氧化、抗炎的功效，并可用作生物材料等[5]。當(dāng)今，糖尿病的病因尚未完全闡述清楚，專家學(xué)者們認(rèn)為其與飲食、精神神經(jīng)因素、炎癥反應(yīng)、遺傳因素等有關(guān)。本課題組前期在整體和細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)，絲膠具有較好的抗糖尿病作用，結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)的絲膠的生物學(xué)作用，進(jìn)一步探究了絲膠抗糖尿病的作用機(jī)制，以期為臨床糖尿病治療提供新思路。

本研究以大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞為研究對象，用STZ模擬糖尿病時(shí)的β細(xì)胞損傷，并給予低、中、高三種不同劑量的絲膠進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，STZ致?lián)p傷的β細(xì)胞ROS水平明顯升高，自噬相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平明顯降低，絲膠干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的變化，且600μg/mL高劑量絲膠的逆轉(zhuǎn)效果最強(qiáng)。本研究一方面可部分揭示絲膠抗糖尿病的作用機(jī)制，另一方面為絲膠的生物學(xué)作用研究提供了數(shù)據(jù)支持。

胰島β細(xì)胞中抗氧化酶的含量和活性均相對較低，因而對ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損害非常敏感，ROS可導(dǎo)致β細(xì)胞的直接和間接損傷[6]。同時(shí)，ROS還可以通過激活核因子Kappa-B、p38絲裂原活化蛋白激酶、己糖胺等信號通路，抑制胰島素刺激的酪氨酸磷酸化，從而降低胰島素的生物效應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗[7-9]。自噬在維持線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的功能方面發(fā)揮重要作用，進(jìn)而維持胰島β細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[10]。當(dāng)自噬缺陷或自噬水平降低時(shí)，可引起β細(xì)胞功能失調(diào)。另外，自噬水平降低的β細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)性降低，可加重β細(xì)胞細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致β細(xì)胞衰竭，造成惡性循環(huán)[3]?？梢?，氧化應(yīng)激損傷和自噬缺陷均在2型糖尿病的發(fā)病過程占有一定地位。

本研究中，絲膠可降低STZ致?lián)p傷INS-1細(xì)胞ROS的水平，提高自噬相關(guān)指標(biāo)LC3B-II/LC3B-I、SIRT1、ATG5、BECLIN1、PINK1等的表達(dá)水平，說明絲膠可減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的直接和間接損傷；另外，絲膠可以改善細(xì)胞自噬水平的降低，進(jìn)而通過維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、提高對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)性，以減輕細(xì)胞損傷。就此提示，絲膠確有保護(hù)STZ致INS-1細(xì)胞損傷的作用，且其保護(hù)機(jī)制與絲膠減輕氧化應(yīng)激和增強(qiáng)自噬作用的功能有關(guān)。

另外，關(guān)于絲膠對氧化應(yīng)激和自噬水平相互關(guān)系的影響尚未可知，且絲膠增強(qiáng)自噬作用進(jìn)而改善線粒體功能的關(guān)系仍不明確。后續(xù)，本課題組將針對上述內(nèi)容進(jìn)行研究，進(jìn)而為開發(fā)針對線粒體治療的藥物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。