王 波，金 雯*，周健坤，陳 良，曹立宇

（1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)護(hù)理系，安徽銅陵 244061；2.合肥市第二人民醫(yī)院高壓氧科；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）已成為全球第六大常見惡性腫瘤，且致死率居癌癥中第三位[1]。早期轉(zhuǎn)移與高復(fù)發(fā)是影響HCC患者預(yù)后的關(guān)鍵。研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，Lnc RNA）在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其可與一些信號(hào)因子互相作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾腫瘤耐藥及影響腫瘤微血管生成等作用[2,3]。LncRNA CUDR是長(zhǎng)鏈非編碼RNA家族的成員之一，有研究表明，CUDR可通過激活A(yù)KT/ERK通路增強(qiáng)胰腺癌的惡性表型[4]，而其在參與肝癌進(jìn)展中的詳細(xì)作用尚不明確。本研究旨在觀察并探討LncRNA CUDR表達(dá)下調(diào)對(duì)HCC侵襲、增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

SMMC-7721細(xì)胞（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；CUDR shRNA慢病毒質(zhì)粒（上海吉瑪公司）；DMEM（美國(guó)Gibco公司）；RPMI 1640和PBS，pH7.4（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（Bio IND，04-002-1A）、Antibiotic-Antimycotic、Trypsin-EDTA（0.05%）和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Lifetechnologies公司）；TRIzol試劑及qPCR試劑盒（上海Beyotime公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SMMC-7721細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱10%胎牛血清中培養(yǎng)，相對(duì)濕度90%；37℃條件下用0.25%胰蛋白酶消化、清洗，加入DMEM/RPMI 1640完全培養(yǎng)基5ml，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，1：2分瓶傳代培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)期接種于6孔板中；至細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書滴入CUDR shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染每孔細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)設(shè)CUDR敲低組、對(duì)照組、空質(zhì)粒組，采用RT-PCR方法檢測(cè)CUDR敲除效率，2-ΔΔCt法計(jì)算CUDR mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)CUDR mRNA的表達(dá) 按TRIzol試劑說明步驟，將細(xì)胞懸液滴入600μl Buffer RL，裂解、離心后，收集mRNA溶液；分光光度計(jì)定量測(cè)定總量；按照qPCR試劑盒說明配置反應(yīng)體系行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR檢測(cè)CUDR mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列設(shè)計(jì)為，CUDR-F：ACGCTAACTGGCACCTTGTT；CUDR-R:CTCCGGACTGCTTCAAGTGT；GAPDHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；GAPDH-R：AGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.2.3 Transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲力 接種前用PBS清洗24孔板和Transwell小室，室中鋪80μl matrigel膠，37℃培養(yǎng)箱中放置30min；用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至密度達(dá)1×105個(gè)/mL，分別吸取0.2ml細(xì)胞懸液接種到Transwell小室內(nèi)，下層加入0.8ml含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；每孔加入1ml 4%多聚甲醛溶液，室溫固定15min；吸去固定液，采用PBS清洗2次，每孔加入0.5%結(jié)晶紫溶液1ml，染色60min，PBS清洗、晾干；于100×顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)下室細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 瘤球成形實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞聚集、增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后離心，用PBS清洗干凈；細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)基中；采用超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔植入500～5000個(gè)細(xì)胞，每3～4d補(bǔ)加培養(yǎng)基；10d后完成培養(yǎng)，觀察細(xì)胞成球狀態(tài)并拍照計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：瘤球長(zhǎng)徑≥30μm。

1.2.5 流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按試劑盒說明書步驟，測(cè)定細(xì)胞凋亡率。1000rpm離心各組細(xì)胞5min；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)1×106/mL，取100μl細(xì)胞懸液，分別加入AnnexinVFITC結(jié)合物和PI solution 各5μl；室溫孵育15min；加入400μl 1×Annexin V Binding Solution后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUDR shRNA轉(zhuǎn)染效率

3組CUDR mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為：CUDR敲低組3.230±0.339；對(duì)照組8.934±0.625；空質(zhì)粒組9.373±0.770；CUDR敲低組與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.215，P＜0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組比較無(wú)差異（P=0.408），見圖1。

圖1 CUDR shRNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.2 Transwell侵襲檢測(cè)結(jié)果

3組穿透下室細(xì)胞數(shù)分別為：CUDR敲低組（49.333±4.412）個(gè)；對(duì)照組（132.500±4.930）個(gè)；空質(zhì)粒組（139.167±6.853）個(gè)。CUDR敲低組與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=496.989，P＜0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組比較無(wú)差異（P=0.053），見圖2。

圖2 敲低CUDR對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞侵襲的影響

2.3 肝癌瘤球成形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3組瘤球成形數(shù)分別為：CUDR敲低組（8.333±1.470）個(gè)；對(duì)照組（33.500±4.930）個(gè)；空質(zhì)粒組（30.333±2.658）個(gè)。CUDR敲低組與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96.685，P＜0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組比較無(wú)差異（P=0.122），見圖3。

圖3 敲低CUDR對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞聚集、增殖的影響

2.4 流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果

3組細(xì)胞凋亡率分別為：CUDR敲低組（9.907±0.732）%；對(duì)照組（4.807±0.451）%；空質(zhì)粒組（4.620±0.682）%。CUDR敲低組與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.259，P＜0.001）；對(duì)照組與空質(zhì)粒組比較無(wú)差異（P=0.731），見圖4。

圖4 敲低CUDR對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

手術(shù)切除是治療HCC最為有效的方法之一，但由于HCC微轉(zhuǎn)移發(fā)生早，高復(fù)發(fā)仍然是導(dǎo)致術(shù)后低生存率的關(guān)鍵。鑒于我國(guó)HCC患者初診時(shí)多已處于中晚期，其術(shù)后中位生存期僅為2年左右[5]。持續(xù)的細(xì)胞惡性增殖是HCC發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)特征，抑制惡性增殖是腫瘤治療的核心原則之一[6]。HCC的發(fā)生、發(fā)展是由多基因突變并涉及諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜生物學(xué)過程[7]。因此，探究HCC發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制可以為治療HCC提供基礎(chǔ)理論支撐。

LncRNAs異常表達(dá)與HCC進(jìn)展關(guān)系密切，被認(rèn)為是HCC診療的潛在靶點(diǎn)。LncRNA MALAT1可與miR-140靶向結(jié)合促進(jìn)肝癌細(xì)胞的血管生成和免疫抑制[8]。Lnc RNA FOXD2-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-206/MAP3K1信號(hào)軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[9]。下調(diào)LncRNA MALAT1可能通過影響PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，遷移及體外成瘤能力[10]。上述表明，LncRNAs可在多條信號(hào)通路中扮演癌基因的角色，進(jìn)一步明確LncRNAs的功能有助于深入認(rèn)識(shí)HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制。LncRNA CUDR具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和多能性的功能[11]。本研究采用CUDR shRNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞并構(gòu)建CUDR穩(wěn)定表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，RT-PCR檢測(cè)顯示，CUDR基因敲低組CUDR mRNA表達(dá)量與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。為探究CUDR在HCC中的作用意義，分別行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和肝癌瘤球成形實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的侵襲、聚集和增殖能力，結(jié)果顯示CUDR敲低后肝癌細(xì)胞侵襲力、聚集和增殖能力與對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示CUDR敲低后肝癌細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。上述提示，調(diào)低CUDR基因可以抑制HCC的侵襲和增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。研究顯示，LncRNA CUDR可與P53（N340Q/L344R）形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步與PKM2的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)PKM2的表達(dá)、磷酸化以及激活系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)HCC的進(jìn)展[12]。LncRNA CUDR可與炎癥細(xì)胞因子IL6相互作用，使MELLT3與SUV39h1 mRNA3'UTR結(jié)合，促進(jìn)SUV39h1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)組蛋白H3對(duì)第九賴氨酸（H3K9me3）的甲基化，增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞的惡性表型[13]。上述內(nèi)容進(jìn)一步說明LncRNA CUDR在HCC發(fā)生、發(fā)展中起致癌基因作用，調(diào)低CUDR可抑制HCC的進(jìn)展，其可能成為HCC治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上，LncRNA CUDR在HCC進(jìn)展中發(fā)揮致癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低CUDR后可以抑制HCC的侵襲和增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，為HCC的靶向治療提供理論依據(jù)。