戈念念，閆向敏，閆如冰，劉建軍

（商丘市第四人民醫(yī)院神經內科，河南商丘 476000）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是因腦損傷引起的高級神經認知功能障礙為主的綜合征，臨床表現(xiàn)為不同程度的認知、社會等功能的下降[1,2]。當前，VaD的診斷主要依賴于病史、臨床表現(xiàn)和影像學檢查等，但此病早期癥狀隱匿，臨床常未能及時發(fā)現(xiàn)和診斷，導致病情進展。因此，明確與VaD發(fā)病密切相關且敏感的指標，對延緩疾病進展和改善預后具有重要作用[3]。血清低氧誘導因子（hypoxia-Inducible factor-1，HIF-1α）是一種受細胞內氧含量調節(jié)的的蛋白因子，當組織缺氧時，血清HIF-1α會升高以保持機體的氧平衡[4]；可溶性細胞凋亡因子（soluble fas，sFas）能夠游離在外周血液中且不具有活性，可抑制凋亡的發(fā)生，有研究顯示其可能參與了VaD細胞凋亡的過程[5]。凋亡抑制蛋白抗體（Livin）是新發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡因子，以Livin為靶點的抑制物可以發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，有報道稱，因炎癥刺激，Livin低表達參與了血管性癡呆的疾病進展[6]。為指導臨床診治，本研究將對上述因子在老年VaD中的表達及臨床意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年8月～2020年10月商丘市第四人民醫(yī)院收治的老年血管性癡呆患者57例作為研究對象。本研究經過倫理委員會許可進行。診斷標準：經MRI檢查結合臨床癥狀確診為VaD[7]。納入標準：（1）符合上述診斷；（2）無意識、精神障礙或其他器官組織嚴重病變；（3）患者及家屬知情同意。排除標準：（1）肝腎功能不全或器官損傷者；（2）自身免疫性疾病或腫瘤患者；（3）影響認知功能的其他疾病。正常健康人為對照組20例，男11例，女9例；年齡60～75歲，平均年齡（67.58±5.74）歲；觀察組患者57例，男28例，女29例；年齡60～76歲，平均年齡（67.92±5.88）歲；根據(jù)臨床癡呆評定量表（clinical dementia rating，CDR）[8]分為輕度癡呆16例，中度癡呆19例，重度癡呆22例。對上述一般資料進行對比，差異不具有統(tǒng)計學分析意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清HIF-1α和Livin水平：采集患者空腹靜脈血5ml，凝固30min后使用血液離心機[翊諾科技(上海)有限公司，TD4X]以3000r/min離心處理10min后，分離血清保存于冰箱中備用。使用ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）測定血清中HIF-1α和Livin水平。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（試劑盒廠家同上）測定標本中sFas水平，采集患者空腹靜脈血5ml，置于溫度為37℃的電熱恒溫水箱中熱浴30min，離心處理后取血清3ml進行sFas的測定，測試方法如下：使用純化的人可溶性細胞凋亡因子抗體包被微孔酶板，將需要測試的血清加入至包被單抗的微孔中，使sFas與辣根過氧化物酶標記的sFas抗體相結合形成抗體-抗原-酶標抗體的復合物，徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺與之結合顯色，四甲基聯(lián)苯胺在辣根過氧化物酶催化下轉換成藍色，在酸的作用下最終轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的sFas濃度呈正相關。最后使用酶標儀[美谷分子(上海)有限公司，SpectraMax iD5]在450nm波長下進行吸光度的測定，通過繪制標準曲線從而計算所測血清中的sFas濃度。上述操作均嚴格按照試劑盒操作使用說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，相關性檢驗使用Speraman等級相關性分析法，多組計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清HIF-1α、sFas和Livin在老年VaD患者中的表達

觀察組患者HIF-1α、sFas較對照組升高，Livin較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 老年VaD患者與對照組HIF-1α、sFas和Livin的水平比較

表1 老年VaD患者與對照組HIF-1α、sFas和Livin的水平比較

與對照組相比*P＜0.05

組別 HIF-1α（pg/mL） sFas（μg/L） Livin（nmol/mL）觀察組（n=57） 498.72±52.98* 220.18±12.46* 7.22±2.16*對照組（n=20） 155.48±50.24 148.97±10.97 12.82±2.54

2.2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同嚴重等級老年VaD患者中的情況

3組患者的HIF-1α無明顯差異（P＞0.05），sFas和Livin水平在重度癡呆患者中的表達較輕中度明顯降低（P＜0.01），且重度患者sFas和Livin水平較中度癡呆患者水平降低（P＜0.05），見表2。

表2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同嚴重等級老年VaD患者中的比較

表2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同嚴重等級老年VaD患者中的比較

與中度相比*P＜0.05，與輕度相比#P＜0.05

ISS分期 HIF-1α（pg/mL） sFas（μg/L） Livin（nmol/L）輕度（n=16） 462.28±88.42 244.77±67.42 9.82±3.14中度（n=19） 486.77±89.61 220.89±64.33 8.01±2.89重度（n=22） 504.87±89.92 170.29±51.64*# 3.54±1.62*#

2.3 血清HIF-1α、sFas和Livin與老年VaD分級的關系

運用Speraman 等級相關性分析方法，結果顯示HIF-1α的水平與VaD分級無明顯相關性（r=0.159，P＞0.05），見圖1A；sFas和Livin與VaD分級呈負相關（r= -0.482、-0.481，P值均小于0.05），見附圖。

附圖 血清HIF-1α、sFas和Livin與老年VaD分級的相關圖

2.4 血清HIF-1α、sFas和Livin指導老年血管性癡呆分級的ROC分析

經過ROC曲線分析，血清HIF-1α、sFas和Livin對VaD分級均有較高的效能。Livin截斷值為7.46nmol/mL時診斷效能較高，其約登指數(shù)為0.821，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.821，敏感度、特異性分別為83.33%、90.91%，見表3。

表3 血清HIF-1α、sFas和Livin指導老年血管性癡呆分級的ROC分析

3 討論

有報道顯示，血管性癡呆占60歲以上老人認知障礙病因的20%，對老年病患的身心健康和家庭成員的生活造成較大的負擔[9,10]。因此，明確敏感高效的指標對老年VaD的早期診治和延緩疾病進展尤為重要。本研究數(shù)據(jù)顯示，老年VaD患者血清HIF-1α和sFas水平較對照組高，血清Livin水平較對照組低，HIF-1α水平與CDR分級無明顯關系，sFas和Livin水平與CDR分級呈負相關，且sFas水平在VaD發(fā)病起始會較正常人明顯升高，隨著疾病進展，sFas在到達一定的峰值之后會隨著腦神經功能損傷的加劇逐漸降低。說明血清HIF-1α、sFas和Livin參與了血管性癡呆疾病的發(fā)生、發(fā)展，血清sFas和Livin含量隨著疾病進展而降低。分析原因為，HIF-1α作為缺氧誘導家族中最先被發(fā)現(xiàn)的誘導蛋白因子，當腦組織缺血缺氧刺激時，機體應激反應機制通過上調HIF-1α的水平來實現(xiàn)自我保護，并通過調控其下游靶基因之一的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與腦保護功能的調節(jié)過程，VEGF可以發(fā)揮促進血管再生的作用[11]，同時在一定程度上改善腦組織缺血狀態(tài)，進而起到保護神經的作用。而HIF-1α與癡呆嚴重程度無明顯關系，考慮是VaD患者腦組織長期處于缺血缺氧狀態(tài)，使得缺血低氧誘導保護機制處于較低水平。細胞凋亡在病理生理過程中表現(xiàn)為一種主動性的細胞自殺形態(tài)，與胚胎形成和衰老病變損傷細胞的清除關系十分密切，Singh等[12]的研究也表明，細胞凋亡活動異常會導致疾病的發(fā)生和進展，與本研究觀點一致。腦組織缺血缺氧刺激后產生諸多細胞因子，激活并上調細胞凋亡因子及其配體，促進了神經細胞的凋亡，所以老年VaD患者的sFas水平較健康人更高[13]。sFas游離在外周血液中，可以選擇性的剪切細胞凋亡因子相關區(qū)域氨基酸殘基的產物，通過與配體結合，阻斷其與細胞膜上的細胞凋亡因子結合，抑制細胞凋亡的發(fā)生。因此，血管性癡呆的的發(fā)生可能與sFas抑制細胞凋亡有關[14]。隨著癡呆程度的加重，sFas保護性因子水平降低，抑制受損傷的神經細胞凋亡并加重疾病進展，故其水平隨著疾病進展和認知障礙的加劇而降低，與癡呆嚴重程度呈負相關。Livin是新近被發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡因子，可以通過直接抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性發(fā)揮抑制凋亡作用，還可以直接與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）前體蛋白以及它的激活形式結合并抑制其活性，阻斷caspase-3對pro-caspase9的反饋性激活，從而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[15]。因此，Livin在炎癥因子刺激下的低表達水平同樣參與了血管性癡呆的進程，隨著病情加重，腦細胞因缺血缺氧受損程度加重使得sFas和Livin水平降低，導致細胞凋亡異常，進一步促進疾病進展。

本研究中，血清HIF-1α、sFas和Livin指導老年CDR的ROC分析結果顯示，血清HIF-1α、sFas和Livin對VaD分級均有較高的效能，Livin對CDR輕中度與重度分級有明顯的診斷鑒別意義，說明血清Livin水平對CDR分級診斷指導意義更大。分析其原因，一是Livin可以在Fas/caspase-8誘導的死亡受體的過程中抑制核心蛋白酶caspase-3的活性，從而抑制死亡途徑發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用；二是Livin在線粒體途徑阻斷caspase-3對pro-caspase9的激活，從而抑制細胞凋亡。血管性癡呆患者的Livin降低，且與體內炎性因子白細胞介素-18與γ干擾素呈負相關，反映Livin在炎癥刺激下參與VaD的發(fā)生，隨著疾病進展，機體應激刺激加重，體內炎性因子分泌增多，進而使得Livin降低。

綜上所述，老年VaD患者血清HIF-1α水平存在一定程度的升高，但與癡呆嚴重程度無明顯相關性，同時sFas、Livin隨著癡呆程度的加重而降低，且與癡呆進展呈負相關，其中Livin對于CDR分級更具有指導意義，能夠輔助指導臨床VaD的診治。