孫萍萍，王佳慧，楊世昭，任 晴，王蔣麗，謝廣成*

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德市疾病預(yù)防控制中心）

腸道病毒A71型（enterovirus-A71，EV-A71）作為手足口?。╤and，foot，and mouth disease，HFMD）的主要病原體之一，其感染引起的HFMD給嬰幼兒的身心健康帶來巨大的負(fù)擔(dān)[1]。我國自2008年發(fā)生大規(guī)模的HFMD暴發(fā)以來，就將HFMD列入國家法定傳染病監(jiān)測名錄，進(jìn)行全國范圍內(nèi)的流行監(jiān)測[2]。EV-A71作為小RNA病毒科腸道病毒屬病毒，其單股正鏈的基因組RNA只編碼一個(gè)多聚前體蛋白并經(jīng)自身編碼的2A和3C蛋白酶剪切成熟為4個(gè)P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）、3個(gè)P2區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B和2C）及4個(gè)P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白（3A、3B、3C和3D）[3,4]。

EV-A71能夠感染不同類型的宿主細(xì)胞同時(shí)活化不同的相關(guān)信號(hào)途徑，作者所在的課題組前期已經(jīng)將該部分進(jìn)行過詳細(xì)綜述[5]。可以明確的是，EV-A71感染宿主細(xì)胞后能夠活化PI3K/AKT途徑和p38途徑[6-8]，且EV-A71感染宿主細(xì)胞后Sam68與Src形成的復(fù)合物能夠與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合[9]。上述研究是基于EV-A71完整活病毒感染宿主細(xì)胞完成的，然而EV-A71進(jìn)入宿主細(xì)胞后，復(fù)制過程中產(chǎn)生的成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在EVA71與宿主細(xì)胞互作中的作用目前仍不清楚。因此，本文開展EV-A71的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞互作的研究，重點(diǎn)關(guān)注EV-A71的亞單位蛋白對(duì)p85表達(dá)和p38途徑的活化，以期為EV-A71與宿主細(xì)胞的互作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腸道病毒A71型阜陽株（GenBank：EU703812）為課題組前期實(shí)驗(yàn)用病毒株[10,11]。pcDNA3.1(+)/myc-His A真核表達(dá)載體購買自Invitrogen公司，質(zhì)粒小量擴(kuò)增后由本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293細(xì)胞為課題組前期使用的細(xì)胞并由本實(shí)驗(yàn)室保存[11]。50ml離心管、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購JET BIOFIL公司；10μl、200μl和1ml無菌微量吸頭、1.5ml離心管購自Axygen公司；PVDF膜購置Merck公司。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA和Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清購自Sigma公司；SuperFect轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA蛋白定量試劑盒、瓊脂糖、BeyoRT? II cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)和Easy-Load? PCR Master Mix（Blue，2X）購自碧云天公司；限制性內(nèi)切酶Hind III和Not I購買自New England Biolabs公司；T4 DNA連接酶購置Promega；青鏈霉素混合液、PBS緩沖液和氨芐青霉素粉末購自索萊寶公司；E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit、E.Z.N.A. Endo-free Plasmid Maxi Kit購自O(shè)MEGA公司；Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit和Viral Nucleic Acid Extraction Kit II 購自Geneaid公司；兔抗人p85和兔抗人p-p38一抗購自CST公司；小鼠抗人β-actin、HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（H+L）購自碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自Biosharp公司；彩色預(yù)染蛋白marker購自Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 EV-A71結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以EV-A71阜陽株的全基因組序列（GenBank：EU703812）為參考序列，采用Primer Premier 5對(duì)EV-A71基因編碼區(qū)的11個(gè)基因片段進(jìn)行全長擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，其中正向和反向引物的5′端分別添加Hind III和Not I限制性內(nèi)切酶的靶序列，送北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行引物合成。采用Viral Nucleic Acid Extraction Kit II進(jìn)行病毒核酸提取，按照BeyoRT? II cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)說明書進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)程序?yàn)?2℃，60min；95℃，5min；4℃，5min；按照50μl的擴(kuò)增體系，使用Easy-Load? PCR Master Mix（Blue，2X）進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系配制，其中正/反向引物各添加2.5μl、cDNA添加2.5μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃，5min；（95℃，30s；55℃，30s；72℃，45s）×40；72℃，10min；4℃，5min。EV-A71的2BC基因片段擴(kuò)增時(shí)使用2B的正向引物和2C的反向引物，3A和3AB基因片段擴(kuò)增時(shí)使用3A共同的正向引物，反向引物為3A和3AB的各自反向引物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外切膠儀下進(jìn)行目的片段的回收，并使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit進(jìn)行目的產(chǎn)物的回收和純化。對(duì)EV-A71結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的12個(gè)基因片段和pcDNA3.1(+)/myc-His A空載體進(jìn)行Hind III和Not I雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用T4 DNA連接酶進(jìn)行EV-A71目的基因與pcDNA3.1(+)/myc-His A載體的連接反應(yīng)，4℃過夜。將連接產(chǎn)物通過42℃熱激60s方式轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂抹于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板，倒置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，提取單菌落加入到5ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。使用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit進(jìn)行重組質(zhì)粒小量提取，送北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序和PCR擴(kuò)增鑒定。

1.3.2 去內(nèi)毒素的EV-A71亞單位基因的重組質(zhì)粒制備 將經(jīng)測序和PCR鑒定正確的EV-A71結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的12個(gè)基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒重新按照上述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化和涂板操作，挑選單菌落加入到30ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日將30ml培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)產(chǎn)物均分成2份，分別加入到300ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。5000rpm離心15min，棄上清收集菌體，直至所有菌體沉淀收集完成。使用E.Z.N.A. Endo-free Plasmid Maxi Kit進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取，并進(jìn)行質(zhì)粒濃度測定。

1.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 使用添加1%青鏈霉素的含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，將細(xì)胞豐度達(dá)90%左右的HEK293細(xì)胞用0.25%Trypsin-EDTA進(jìn)行細(xì)胞消化并接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待HEK293細(xì)胞豐度達(dá)60%～70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。按照SuperFect Transfection Reagent試劑盒說明書使用無血清的Opti-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每孔細(xì)胞按照2μg質(zhì)粒的劑量進(jìn)行轉(zhuǎn)染，室溫靜止30min后，觀察轉(zhuǎn)染復(fù)合物的渾濁度；每孔按照100μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物的體積添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h后，使用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，加入到新鮮含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)24h，每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染設(shè)置3個(gè)獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)組。1.3.4 免疫印跡檢測 轉(zhuǎn)染時(shí)間達(dá)24h后，盡量去除DMEM培養(yǎng)基，使用添加過蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解HEK293細(xì)胞，收取總蛋白并使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，制備SDS-PAGE電泳上樣蛋白樣品，使用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；使用含有20%甲醇的轉(zhuǎn)膜液在100V下轉(zhuǎn)膜60min，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；將轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜加入到含有5%脫脂奶粉的PBST封閉液中進(jìn)行室溫封閉1h；將p85、p-p38和β-actin一抗按照1:1000的比例進(jìn)行稀釋，一抗4℃孵育PVDF膜過夜；PBST洗液清洗3次，每次10min；HRP標(biāo)記的二抗也按照1:1000的比例進(jìn)行稀釋，室溫孵育PVDF膜2h；PBST洗液清洗3次，每次10min；使用ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 EV-A71結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

EV-A71基因組的P1區(qū)的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1（891bp）、VP2（762bp）、VP3（726bp）和VP4（207bp）；P2區(qū)的3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白基因2A（450bp）、2B（297bp）、2C（987bp）；P3區(qū)的4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白基因3A（258bp）、3C（549bp）、3D（1386bp）、3AB（324bp）（因3B只有66bp，所以將3A、3B構(gòu)建在一起），此外還構(gòu)建了2BC（1284bp），均呈現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶（圖1）。因此，將構(gòu)建的EV-A71基因組亞區(qū)域的12個(gè)真核質(zhì)粒分別命名為pcDNA3.1-EV71-VP1/VP2/VP3/VP4/2A/2B/2C/2BC/3A/3C/3D/3AB。12個(gè)真核重組質(zhì)粒經(jīng)序列測定與EV-A71基因組（GenBank：EU703812）的序列一致。

圖1 EV-A71亞單位蛋白基因的PCR鑒定

2.2 EV-A71 P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白改變p85表達(dá)和p38途徑的活化

將2μg的pcDNA3.1-EV71-VP1/VP2/VP3/VP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞24h后，EV-A71的P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP3和VP4能夠上調(diào)p85的表達(dá)水平；EV-A71的結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3和VP4能夠提升p38的磷酸化水平（圖2）。

圖2 EV-A71 P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)p85表達(dá)和p38途徑活化的影響

2.3 EV-A71 P2區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白改變p85表達(dá)和p38途徑的活化

將2μg的pcDNA3.1-EV71-2A/2B/2C/2BC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞24h后，EV-A71的P2區(qū)4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C和2BC均能顯著提升p85的表達(dá)水平和p38的磷酸化水平（圖3）。

圖3 EV-A71 P2區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)p85表達(dá)和p38途徑活化的影響

2.4 EV-A71 P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白改變p85表達(dá)和p38途徑的活化

將2μg的pcDNA3.1-EV71-3A/3C/3D/3AB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞24h后，EV-A71的3A、3C、3D和3AB均能提升p85的表達(dá)水平，特別是EV-A71 3A蛋白提升p85表達(dá)最為明顯。EV-A71的3A、3C、3D和3AB均能提升p38的磷酸化水平，特別是EV-A71 3AB的提升效果最為明顯（圖4）。

圖4 EV-A71 P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)p85表達(dá)和p38途徑活化的影響

3 討論

磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）途徑是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，該途徑能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和細(xì)胞代謝等不同過程[12]。PI3K家族依據(jù)結(jié)構(gòu)和底物特異性的不同，可以分為PI3K IA和IB、PI3K II和PI3K III成員，其中PI3K IA是由催化亞基（p110α、p110β和p110δ）和調(diào)節(jié)亞基（p85α、p85β、p55γ、p55α和p50α）互作形成的異源二聚體[13]。前期研究和作者所在課題組的研究都表明，EV-A71感染宿主細(xì)胞后能夠活化PI3K/AKT途徑[6,7,14]，同時(shí)明確EV-A71感染能夠引起Sam68/Src復(fù)合物與p85互作[9]，但是將EV-A71基因組編碼經(jīng)EV-A71的2A和3C蛋白酶剪切成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白到底能不能與PI3K互作，目前仍是未知。關(guān)于EV-A71編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的功能目前已經(jīng)基本確定[3,15]。總的來說，EV-A71的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成EV-A71的衣殼，其中VP1、VP2和VP3位于衣殼表面、VP4位于衣殼內(nèi)部[16]。VP1主要介導(dǎo)與病毒受體的結(jié)合[17]，是表面抗原的同時(shí)還具有主要的抗原結(jié)合位點(diǎn)[18]。VP2和VP3同樣與EV-A71的抗原性有關(guān)，VP2的142-146位氨基酸是一個(gè)線性、非中和抗原表位，將144位氨基酸進(jìn)行S/T單點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致VP2的抗原性丟失[19]。VP3的55-69位氨基酸是一個(gè)新的構(gòu)象表位[20]。VP4蛋白能夠插入到細(xì)胞膜上形成通道，讓EV-A71的基因組RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而完成脫殼過程[21]。目前已知EV-A71的非結(jié)構(gòu)蛋白的主要功能是促進(jìn)病毒復(fù)制，特別是EV-A71的2A和3C蛋白可通過剪切天然免疫的重要受體和配體分子實(shí)施免疫逃逸，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制[3,5,15,22]。另外，EV-A71的3D聚合酶還能夠引起宿主細(xì)胞周期的阻滯[23]。本研究通過構(gòu)建EV-A71的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的真核重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入到HEK293細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)除了EV-A71的結(jié)構(gòu)蛋白VP2外，結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP3和VP4）及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白均能提高PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85的表達(dá)水平，這一結(jié)果意味著EVA71的這些亞單位蛋白能夠潛在與p85互作，但是具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入研究。目前的研究進(jìn)展顯示，流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的YXXM基序（YLTDM，89-93aa）基序能夠結(jié)合p85的SH2區(qū)，而NS1的PXXP（PSLP，164-167aa）基序能夠結(jié)合p85的SH3區(qū)[24]；塞姆利基森林病毒通過nsP3蛋白的YXXM基序（YEPM，369-372aa）與p85的SH2區(qū)結(jié)合活化PI3K/AKT途徑，進(jìn)而活化細(xì)胞糖酵解，最終促進(jìn)SFV復(fù)制[25]。因此，本研究結(jié)果提示，EV-A71也有可能利用其結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，通過互作p85后活化PI3K/AKT途徑，最后調(diào)控宿主細(xì)胞的糖代謝過程，并為EV-A71的復(fù)制提供能量來源，然而這一科學(xué)假設(shè)仍需要進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

p38信號(hào)途徑也是細(xì)胞內(nèi)的一條重要途徑，涉及到組織自穩(wěn)態(tài)、免疫反應(yīng)、病毒復(fù)制等不同過程[26]。抑制人皮膚成纖維細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的p38信號(hào)途徑，進(jìn)而抑制馬亞羅病毒的復(fù)制[27]。另外，新城疫病毒[28]、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）[29]都能夠在其感染過程中活化p38途徑，促進(jìn)病毒的復(fù)制水平。HCV還能夠通過活化p38途徑來介導(dǎo)細(xì)胞糖代謝過程，最終調(diào)控HCV子代病毒粒子的釋放[30]。本研究證實(shí)了EV-A71的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白能夠不同程度的調(diào)控p38的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控p38途徑的活化，但是p38途徑的活化是否也能夠介導(dǎo)宿主細(xì)胞糖代謝過程最終影響EV-A71的復(fù)制，目前仍是未知，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究確定了EV-A71的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白能夠在一定程度上調(diào)控p85的表達(dá)和p38途徑的活化，說明EV-A71在感染宿主細(xì)胞后的復(fù)制過程中能夠通過其復(fù)制產(chǎn)生的成熟的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞互作，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的糖酵解、細(xì)胞凋亡等過程，但是具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入研究。