姚軼敏 李 強(qiáng)

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是臨床上最常見的自身免疫性出血性疾病，血小板破壞增加及生成減少是其主要表現(xiàn)，可導(dǎo)致皮膚黏膜出現(xiàn)瘀點、瘀斑、內(nèi)臟出血甚至腦出血，危及生命。中醫(yī)將ITP 稱為“紫癜病”，屬于中醫(yī)“血證”等范疇，臨床以“脾氣虛弱，氣不攝血”為基本病機(jī)，這也是健脾益氣法治療ITP 的理論依據(jù)[1]。中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療ITP 有獨特優(yōu)勢，經(jīng)激素治療無效或復(fù)發(fā)的患者臨床上采用中醫(yī)治療?？色@得良好的臨床療效。但對于健脾益氣法治療ITP 的藥效機(jī)制，尚缺乏足夠的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論依據(jù)及有力的實驗室證據(jù)。健脾益氣方是在健脾方的基礎(chǔ)上加減藥味而成，組方為黨參、甘草、茯苓、黃芪、茜草、白術(shù)、阿膠[2]，可以健脾、補(bǔ)氣、養(yǎng)血，促進(jìn)血液循環(huán)，在臨床實踐中被用于治療ITP[3-4]。目前，對于該復(fù)方制劑的作用途徑和作用靶點尚不清楚，這是限制其廣泛應(yīng)用的主要因素。在本研究中，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)來鑒定和篩選健脾益氣方治療ITP 可能的機(jī)制和關(guān)鍵靶點。

1 資料與方法

1.1 健脾益氣方藥物活性成分及作用靶點的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索出健脾益氣方中黨參、甘草、茯苓、黃芪、茜草、白術(shù)、阿膠7 種中藥的化學(xué)成分。根據(jù)藥物動力學(xué)參數(shù)（ADME）對化學(xué)成分進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服利用度（OB）≥30%，化合物類藥性（DL）≥0.18。BATMAN-TCM 根據(jù)分?jǐn)?shù)截止值為20，預(yù)測的候選目標(biāo)（包括已知的目標(biāo)）其得分不小于20，多次測試校正后設(shè)置P 值的截止值（調(diào)整后的P 值）小于0.05。將TCMSP 數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選到的各味中藥的活性成分進(jìn)行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣方主要活性成分。將篩選到的活性成分通過PubChem 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SMILES 晶體結(jié)構(gòu)查詢，將不能查詢到晶體結(jié)構(gòu)的活性成分進(jìn)行剔除，將查詢到的各活性成分晶體結(jié)構(gòu)上傳到SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測。然后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將篩選出的靶點名稱轉(zhuǎn)化為Gene Symbol，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點，建立活性成分靶點數(shù)據(jù)集，備用。

1.2 ITP 疾病靶點的獲取 以“immune thrombocytopenia”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）以及DisGenet（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取ITP 相關(guān)的疾病靶點。然后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將篩選出的靶點名稱轉(zhuǎn)化為Gene Symbol，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點，建立疾病靶點數(shù)據(jù)集，備用。

1.3 關(guān)鍵靶點篩選及構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用R 語言（涉及的R 包：ggplot2 包，用于可視化），將健脾益氣方活性成分靶點和ITP 相關(guān)的疾病靶點進(jìn)行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣組分與ITP 交集靶標(biāo)，即為健脾益氣方治療ITP 的關(guān)鍵靶點。將關(guān)鍵靶點在STRING 數(shù)據(jù)庫在線平臺（https://stringdb.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定研究物種為“homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)為“medium confidence”（＞0.4），其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，下載PPI 網(wǎng)路TSV 文件備用。

1.4 關(guān)鍵靶點基因功能（GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將藥物-疾病共同基因用R 語言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可視化）進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化。

1.5 TOP10 GO 注釋和KEGG 通路富集分析 為了進(jìn)一步篩選到可能的關(guān)鍵靶點，我們將關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)路TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件處理，通過Cytoscape 中的cytohubba 插件來評估程度。cytohubba 目前有12 種算法，各種算法之間沒有優(yōu)劣，本研究使用最新的MCC 算法，得到分?jǐn)?shù)前十的基因，并用R 語言（R 包：clusterProfiler 包[1]，用于富集分析和可視化）進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化，得出健脾益氣方治療ITP 的關(guān)鍵靶點和通路。

1.6 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點 為了探討健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點，我們將健脾益氣方治療ITP 的關(guān)鍵靶點與從人類自噬數(shù)據(jù)庫中共獲得基因（http://www.autophagy.lu/）進(jìn)行映射，繪制韋恩圖，獲得健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)交集靶標(biāo)，即健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點。

1.7 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點GO 注釋和KEGG 通路富集分析 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點用R 語言進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路富集析和可視化。

1.8 構(gòu)建健脾益氣方各味中藥-活性成分－自噬相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò) 將中藥、活性成分及自噬相關(guān)靶點整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.9 推測健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)可能的關(guān)鍵靶點 為了進(jìn)一步分析健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)關(guān)鍵靶點，我們將22 個活性成分的靶點分別與健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點進(jìn)行映射，韋恩得到各活性成分治療ITP 自噬相關(guān)靶點，根據(jù)靶點的計數(shù)，獲得健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)可能的關(guān)鍵靶點。

2 結(jié)果

2.1 健脾益氣方活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫共篩選出健脾益氣方中7 味中藥及35 種活性成分，其中黨參7 種、甘草8 種、茯苓2 種、黃芪5種、茜草3 種、白術(shù)7 種、阿膠3 種（見圖1）。在Pub－Chem 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SMILES 晶體結(jié)構(gòu)查詢，其中22 種中藥活性成分查詢到了SMILES 晶體結(jié)構(gòu)（見表1）。在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點預(yù)測，所有成分得到靶點去除重復(fù)后有763 個。

圖1 5 種中藥在TCMSP 數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中的共同活性成分韋恩圖

表1 健脾益氣方活性成分信息

2.2 ITP 疾病靶點的篩選及共同靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards、DrugBank 以及DisGenet 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點，獲得ITP相關(guān)的疾病靶點3130 個。將這3130 個疾病靶點與763 個健脾益氣方活性成分的作用靶點用R 語言繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得疾病-活性成分共同靶點337 個，此即健脾益氣方治療ITP 有重要意義的靶點（見圖2A）。在STRING 數(shù)據(jù)平臺輸入337 個共同靶點，分析后得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2B）。

圖2 健脾益氣方活性成分的作用靶點與ITP 相關(guān)的疾病靶點的韋恩圖（A）；337 個共同靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（B）

2.3 337 個關(guān)鍵靶點GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 為了分析這些共同靶點的潛在生物學(xué)功能，我們用R 語言對健脾益氣方活性成分-ITP 疾病的337 個共同靶標(biāo)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可視化（見圖3）。337 個共同靶點在生物過程方面，主要富集在肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、肽基絲氨酸修飾；在細(xì)胞組分方面，主要富集在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)；在分子功能方面，主要富集在蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性；KEGG 通路方面，主要富集在EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、前列腺癌、PI3K/Akt 信號通路。

圖3 健脾益氣方活性成分-ITP 疾病的337 個共同靶標(biāo)GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網(wǎng)路圖

2.4 TOP10 靶基因GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 根據(jù)MCC 算法，得到分?jǐn)?shù)前十的基因是CCND1、BCL2L、CASP3、HSP90AA1、JUN、SRC、STAT3、MTOR、HIFA1、VEGFR，用R 語言對關(guān)鍵共同靶標(biāo)進(jìn)行GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析，得到GO 和KEGG 富集結(jié)果及富集分析圖（見圖4）。TOP10 共同靶點在生物過程方面，主要富集在抗生素反應(yīng)、髓樣細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控；在細(xì)胞組分方面，主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、谷氨酸能突觸；在分子功能方面，主要富集在泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、組蛋白去乙?；附Y(jié)合；在KEGG通路方面，主要富集在癌癥中的蛋白多糖、胰腺癌、PI3K/Akt 信號通路。

圖4 根據(jù)MCC 算法，得分前十的健脾益氣方治療ITP 關(guān)鍵共同靶標(biāo)（A）及其GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網(wǎng)路圖（B）

2.5 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)靶點GO 生物功能注釋和KEGG 通路富集分析 健脾益氣方治療ITP 的關(guān)鍵靶點與從人類自噬數(shù)據(jù)庫中共獲得基因進(jìn)行映射，得到健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)交集靶標(biāo)36 個（見圖5A）。將36 個共同靶標(biāo)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析以及可視化（見圖5B）。36 個共同靶標(biāo)在生物過程方面，主要富集在肽基絲氨酸修飾、肽基絲氨酸磷酸化、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)；在細(xì)胞組分方面，主要富集在富含ficolin-1顆粒、膜筏、膜微區(qū)；在分子功能方面，主要富集蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、MAP 激酶活性；在KEGG 通路方面，主要富集在自噬、凋亡、胰腺癌。

圖5 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)交集靶標(biāo)韋恩圖（A）；36個健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)共同靶標(biāo)GO 富集分析和KEGG 通路富集分析可視化網(wǎng)路圖（B）

2.6 健脾益氣方各味中藥-活性成分－自噬相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 軟件對中藥、活性成分、自噬相關(guān)靶點進(jìn)行可視化分析，得到中藥-活性成分－自噬相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 中藥-活性成分－自噬相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)可能的關(guān)鍵靶點 根據(jù)靶點計數(shù)分析，EGFR、PARP1、MTOR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等是健脾益氣方治療ITP 自噬相關(guān)可能的關(guān)鍵靶點，見圖7。

圖7 健脾益氣方各活性成分治療ITP 自噬相關(guān)靶點計數(shù)柱狀圖

3 討論

研究表明，ITP 患者的血小板自噬減少，血小板自噬通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路進(jìn)行調(diào)控[5]。升高的血小板自噬可能通過抑制血小板凋亡和提高血小板活力來延長ITP 患者血小板的壽命[5]。此外，自噬在巨核細(xì)胞生成、血小板生成和血小板功能中的新作用在血小板減少癥患者中也已得到揭示[6]。這些提示通過對ITP 患者自噬調(diào)節(jié)有可能為ITP 治療提供新的方向。

臨床實踐提示，健脾益氣方在改善ITP 患者出血癥狀及調(diào)節(jié)免疫等方面具有良好的療效[7]，但對于健脾益氣方治療ITP 的具體藥效機(jī)制，尚缺乏足夠的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論依據(jù)及有力的實驗室證據(jù)。研究表明，黨參的有效活性成分豆甾醇可以通過抑制Akt/mTOR 途徑同時誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和保護(hù)性自噬[8]。雷帕霉素（mTOR）介導(dǎo)的自噬的哺乳動物靶標(biāo)被鑒定為甘草有效活性成分葛蘭素的潛在介質(zhì)之一，通過保護(hù)軟骨細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡和促進(jìn)mTOR 介導(dǎo)的自噬，保護(hù)特性軟骨免受骨關(guān)節(jié)炎損傷的影響[9]。甘草和黃芪共同有效活性成分山奈酚與mTOR 抑制劑的作用相似，它可通過抑制人內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路上調(diào)自噬，從而減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。甘草和黃芪共同有效活性成分槲皮素通過Akt/mTOR 途徑介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)對細(xì)胞遷移和糖酵解產(chǎn)生抑制作用[11]。茯苓有效活性成分茯苓酸，增加了老化細(xì)胞中與自噬相關(guān)的蛋白如LC3-Ⅱ和Beclin-1 的表達(dá)，并降低了mTOR 磷酸化[12]。我們認(rèn)為健脾益氣方中黨參、甘草、黃芪、茯苓中的有效活性成分可充當(dāng)mTOR 抑制劑的作用，通過抑制PI3K/Akt/mTOR 通路上調(diào)自噬，特別是甘草和黃芪中的多個有效活性成分有自噬誘導(dǎo)作用。因此，我們猜想健脾益氣方通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路靶向自噬可能為ITP 的治療提供新的方法。

在本研究中，我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息信息學(xué)研究健脾益氣方治療ITP 的藥理學(xué)機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得到22 種化合物，337 個關(guān)鍵靶點，多條靶基因調(diào)控途徑以及TOP10 靶基因。MTOR 基因主要編碼激酶mTOR，mTOR 是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白，細(xì)胞缺氧、應(yīng)激都可直接或間接通過mTOR 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的發(fā)生[13]。此外，PI3K/Akt 通路是調(diào)節(jié)mTOR 的主要上游信號通路之一。最近的研究表明，ITP 中的血小板自噬受PI3K/Akt/mTOR 通路調(diào)節(jié)，mTOR 作為負(fù)調(diào)節(jié)因子，Ⅲ類PtdIns3K 在該過程中起關(guān)鍵作用[14]。增強(qiáng)血小板自噬通過抑制細(xì)胞凋亡和提高血小板活力來減輕血小板破壞。因此我們可以推測，ITP 患者存在PI3K/Akt/mTOR 異常導(dǎo)致自噬功能減輕，而健脾益氣方有可能通過對ITP 血小板的自噬調(diào)節(jié)從而起到治療作用。

為了進(jìn)一步探討健脾益氣方有可能通過哪些關(guān)鍵靶點調(diào)節(jié)血小板自噬治療ITP，根據(jù)各活性成分靶點計數(shù)分析，EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6 等可能是健脾益氣方治療ITP 調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵靶點。EGFR 是一種酪氨酸激酶，可將細(xì)胞外信號與細(xì)胞存活、生長、增殖和分化的控制聯(lián)系起來，已證明EGFR 是自噬具有細(xì)胞保護(hù)或細(xì)胞毒性作用的關(guān)鍵決定因素。EGFR 下游的PI3K/AKT1 軸可以通過調(diào)節(jié)自噬抑制劑mTOR 來調(diào)節(jié)自噬[15]。PARP1 可修復(fù)DNA 中的單鏈斷裂，并在自噬調(diào)節(jié)中起重要作用。PARP1 是DNA 損傷、活性氧和饑餓誘導(dǎo)的自噬的重要積極調(diào)節(jié)因子。PARP1 激活和三磷酸腺苷耗竭通過AMPK 激活和mTOR 抑制介導(dǎo)細(xì)胞死亡和自噬[16]。BCL2L1 是線粒體中的一種跨膜分子，被認(rèn)為是自噬的重要因子，通過與Beclin-1 結(jié)合抑制Beclin-1 介導(dǎo)的自噬[17]。RAF1 是MEK/ERK信號傳導(dǎo)的上游調(diào)節(jié)因子，Raf/MEK/ERK 激活引起LC3B 和SQSTM1 表達(dá)增加，LC3B 和SQSTM1是關(guān)鍵的自噬標(biāo)志物[18]。LC3B 作為一種RNA 結(jié)合蛋白和mRNA 衰減子發(fā)揮作用，是高效自噬所必需的[19]。SQSTM1 又名p62，是最早被研究發(fā)現(xiàn)的自噬接頭蛋白，在選擇性自噬中起著至關(guān)重要的作用[20]。BCL2 是自身免疫性疾病、腫瘤或損傷中自噬和細(xì)胞凋亡之間的交叉點。此外，大量研究表明BCL2 參與了多種疾病的細(xì)胞凋亡和自噬。這種參與取決于含有BCL2 的復(fù)合物的形成，在細(xì)胞應(yīng)激條件下，BCL2 的減少導(dǎo)致與Beclin-1 的結(jié)合減少，游離Beclin-1 增加，從而促進(jìn)自噬[21]。而目前的結(jié)果表明，與正常血漿相比，ITP 血漿中Beclin-1 下調(diào)，而BCL2上調(diào)[22]。HDAC6 是一種獨特的Ⅱ類HDAC，研究表明HDAC6 可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 通路減輕朊病毒肽介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，這種保護(hù)作用涉及自噬的激活和mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的PI3K/Akt 哺乳動物靶點的調(diào)節(jié)[23]。EGFR、PARP1、MOTR、HDAC6 通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路來靶向自噬，而RAF1、BCL2L1 和BCL2 作為自噬的重要因子調(diào)節(jié)自噬。所以，我們認(rèn)為健脾益氣方治療ITP，可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路或調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白來完成。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析表明，傳統(tǒng)中醫(yī)藥組分健脾益氣方通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路或自噬的關(guān)鍵蛋白來靶向自噬可能為ITP 提供一種有前景的治療方法。EGFR、PARP1、MOTR、BCL2L1、RAF1、BCL2、HDAC6等分子可能是健脾益氣方誘導(dǎo)自噬，抑制血小板凋亡，治療ITP 的關(guān)鍵靶點。但其具體的調(diào)控機(jī)制和關(guān)鍵的靶點還有待實驗研究進(jìn)一步證實。