樂純琰 楊國蓉 傅杭杰 高天問 丁 濱 季巾君

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)廣泛，從輕度皮疹到血液異常、腎損傷和神經(jīng)精神受累等，其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為與遺傳、內(nèi)分泌、免疫和環(huán)境因素（如飲食、藥物、感染）等有關(guān)[1]。我國約有超過100 萬SLE 患者，其中女性患者高達(dá)113/10 萬人，且該數(shù)據(jù)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2]。全基因關(guān)聯(lián)研究確定了50 多個(gè)與SLE 相關(guān)的基因位點(diǎn)，特別是涉及免疫調(diào)節(jié)途徑的基因，其中包括干擾素調(diào)節(jié)因子5（IRF5）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）、白細(xì)胞介素10（IL-10）等[3]。大量研究表明，STAT 信號(hào)通路在SLE 中表達(dá)異常，STAT 蛋白被絲氨酸磷酸化后可進(jìn)一步參與其他重要途徑，如p38/MAPK 途徑、mTOR 途徑、蛋白激酶R 途徑等[4]，而未磷酸化的STAT 也可以通過其他轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB 的相互作用參與其他基因的表達(dá)[5]。

根據(jù)《金匱要略》中升麻鱉甲湯研制而成的解毒祛瘀滋陰方已廣泛用于SLE 的臨床治療，且療效明顯，主要成分之一的積雪草被證實(shí)有活血祛瘀的功效[6]。芹菜素是一種廣泛分布于水果、蔬菜和中草藥的天然黃酮類化合物，這類化合物作為自由基清除劑和抗氧化劑，表現(xiàn)出抗氧化、抗炎和抗癌的作用；能夠抑制細(xì)胞周期，減少氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)凋亡，刺激免疫系統(tǒng)，影響包括p38/MAPK、PI3K/Akt 和NF-κB通路，在抗炎和免疫調(diào)節(jié)中有很好的應(yīng)用[7]。因此我們推測(cè)積雪草中的芹菜素可能在治療SLE 中發(fā)揮一定作用。但目前對(duì)于芹菜素治療SLE 的研究尚未見報(bào)道，因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，利用多個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了芹菜素和SLE 的潛在靶點(diǎn)，并通過基因功能基因功能（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析研究芹菜素治療SLE 的可能機(jī)制，研究流程圖如圖1 所示。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究流程圖

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 材料：人腎上皮細(xì)胞（293T 細(xì)胞）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；pERα-Luc、pERβ-Luc、pNF-κB-Luc 及相應(yīng)表達(dá)載體flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）、Renilla 為實(shí)驗(yàn)室備存；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司（貨號(hào)：E195A）；芹菜素購自上海源葉生物科技有限公司（貨號(hào)：S31423-1g）。

試劑：DMEM 培養(yǎng)液（貨號(hào)：SH30285.02）、胎牛血清（貨號(hào)：SH30088.03）購自Hyclone 公司；脂多糖（LPS）（貨號(hào)：L2880-10MG）、β-雌二醇（β-E2）（貨號(hào)：E110145-1g）、二甲基亞砜（DMSO）（貨號(hào)：D8418-50ML）購自美國Sigma 公司；SuperFectinTMⅡIn Vitro DNA Transfection Reagent 購自上海普飛生物有限公司（貨號(hào)：2102-100）。

1.2 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)[蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1F（D）/2FCD]；水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：TS-1）；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號(hào)：MCO-5M）；多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：5200110）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 芹菜素靶點(diǎn)的篩選 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）輸入化合物名稱，下載芹菜素的2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）及PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)出芹菜素的潛在靶點(diǎn)，借助Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對(duì)篩選的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行矯正規(guī)范。

1.3.2 SLE 靶點(diǎn)篩選 以“systemic lupus erythematosus”為關(guān)鍵詞輸入OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）及PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫檢索，整理刪除重復(fù)項(xiàng)后即得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3.3 芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)篩選及“疾病-靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將芹菜素和SLE 的靶點(diǎn)輸入Venny2.1在線作圖平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，兩者交集即為芹菜素和SLE 的共同靶點(diǎn)，并運(yùn)用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-化合物”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.4 芹菜素-SLE 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 將篩選得到的共同靶點(diǎn)上傳至STRING 在線數(shù)據(jù)庫（https://www.stringdb.org/），設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲得芹菜素-SLE 的蛋白互作關(guān)系，并將蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系下載為TSV 格式，利用Cytoscape 3.8.2 將其可視化為PPI 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行共同基因的分析及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.3.5 芹菜素-SLE 基因功能及通路富集分析 將共同靶點(diǎn)上傳到DAVID 數(shù)據(jù)庫中（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行GO 富集分析，基于R4.1.1軟件用Bioconductor 生物信息軟件包進(jìn)行KEGG 通路富集分析，對(duì)芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)功能及主要信號(hào)通路分析，將結(jié)果以條形圖或氣泡圖形式輸出。在本研究中，P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證篩選的主要信號(hào)通路 293T 細(xì)胞鋪48 孔板，將pERα-Luc、pERβ-Luc 和pNF-κB-Luc 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別與相應(yīng) 的表達(dá)載 體flag-ERα、flag-ERβ 和cmyc-NF-κB（p65）和內(nèi)參質(zhì)粒Renilla 共同轉(zhuǎn)染24 h后，pERα-Luc 和pERβ-Luc 用β-E2（20 μg/mL）刺激，pNF-κB-Luc 用LPS（1 mM）刺激18 h 后收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。本研究采用GraphPad Prism 8.3 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)的篩選及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得的芹菜素2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，共預(yù)測(cè)出芹菜素潛在靶點(diǎn)77 個(gè)（見表1）。同時(shí)以“systemic lupus erythematosus”為關(guān)鍵詞，篩選得到SLE 潛在靶點(diǎn)1016 個(gè)，韋恩圖中取交集后獲得共同基因21 個(gè)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，繪制出芹菜素-SLE-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，圖中藍(lán)色三角形代表21 個(gè)共同靶點(diǎn)，綠色錐形代表疾病，橙色菱形代表芹菜素（見圖2）。

表1 芹菜素靶點(diǎn)信息

圖2 芹菜素-SLE-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 PPI 網(wǎng)絡(luò)是通過上傳21 個(gè)共同靶點(diǎn)到STRING 數(shù)據(jù)庫，并以Confidence score＞0.4 和人類為條件篩選得到有關(guān)系的蛋白，并通過Cytoscape 軟件將蛋白之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化處理，獲得了一個(gè)具有18 個(gè)節(jié)點(diǎn)，44條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（如圖3）。在該網(wǎng)絡(luò)圖中，核心度較高的靶點(diǎn)用較大的節(jié)點(diǎn)和較亮的顏色表示，相關(guān)度較強(qiáng)的靶點(diǎn)邊緣用較粗和較亮的線表示。選擇核心度最大的3 個(gè)靶點(diǎn)作為芹菜素治療SLE 的核心靶點(diǎn)：ALB、HSP90AA1 和ESR1。

圖3 芹菜素治療SLE 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.3 靶點(diǎn)富集通路分析 首先，將21 個(gè)芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)上傳到DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO 富集分析，包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個(gè)部分。GO 數(shù)據(jù)分析共富集到37 條生物學(xué)功能、12 條細(xì)胞組成過程和26 條分子功能過程，以P＜0.05 和基因富集程度為篩選條件，分別選出前十的結(jié)果進(jìn)行分析（如圖4）。

圖4 芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過程富集分析

再將21 個(gè)芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)經(jīng)R 語言運(yùn)行后進(jìn)行KEGG 通路分析，共得到12 條KEGG 通路，分別為精氨酸和脯氨酸代謝通路（arginine and proline metabolism）、雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、苯丙氨酸代謝通路（phenylalanine metabolism）、組氨酸代謝通路（histidine metabolism）、化學(xué)致癌作用-受體激活（chemical carcinogenesisreceptor activation）、NF-κB 信號(hào)通路（NF-κB signaling pathway）、冠狀病毒病-COVID-19（coronavirus disease -COVID -19）、血清素突觸（serotonergic synapse）、血小板活化（platelet activation）、酪氨酸代謝通路（tyrosine metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路（glycine，serine and threonine metabolism）、色氨酸代謝通路（tryptophan metabolism）。根據(jù)P 值，將12 條通路進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，形成氣泡圖（見圖5）。

圖5 芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證篩選的主要信號(hào)通路 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，芹菜素能夠抑制由β-E2 激活的ERα 和ERβ 的轉(zhuǎn)錄，其中對(duì)ERβ 的影響極顯著（P＜0.01）（見圖6A、B）；同時(shí)，芹菜素能夠顯著抑制由LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）（見圖6C）。芹菜素的抑制活性表現(xiàn)出劑量依賴，但趨勢(shì)不明顯（P＞0.05）。

圖6 不同濃度芹菜素對(duì)ERα（A）、ERβ（B）、NF-κB（C）轉(zhuǎn)錄活力的影響

3 討論

SLE 是一種涉及多器官、多系統(tǒng)的炎癥性自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]，目前臨床上的常用藥有激素和免疫抑制劑等，但不良反應(yīng)較大[6]。解毒祛瘀滋陰方以生地黃為君藥，加以升麻、白花蛇舌草、薏苡仁、積雪草為臣藥，增強(qiáng)清熱解毒之功，再加以其他佐藥和使藥，起到滋陰益腎、清熱解毒之效，在降低激素的毒副作用、緩解患者病情、改善體力和疲勞程度、促進(jìn)生理和心理康復(fù)、提高生存質(zhì)量方面大有裨益[6]。然而，中藥復(fù)方由于活性成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多樣，闡明其藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為化合物與疾病作用關(guān)系靶點(diǎn)和機(jī)制的研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展和創(chuàng)新提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選到了77 個(gè)芹菜素潛在靶點(diǎn)和1016 個(gè)SLE 疾病靶點(diǎn)，兩者交集得到21 個(gè)芹菜素-SLE 共同靶點(diǎn)，其中TOP 前三為ALB、HSP90AA1 和ESR1。ALB 能調(diào)節(jié)凝血功能，降低炎癥因子毒性，臨床研究發(fā)現(xiàn)SLE 患者體內(nèi)ALB 水平顯著降低，推測(cè)可能與機(jī)體過度免疫有關(guān)[8]。HSP90是分子伴侶蛋白，參與炎癥相關(guān)免疫過程，能促進(jìn)各種促炎細(xì)胞因子和抗原相互作用；HSP90AA1 是HSP90 的家族成員之一，通過調(diào)控編碼HSP90α 蛋白，參與機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)[9]。雌激素已被證明在SLE 的發(fā)生發(fā)展中通過細(xì)胞內(nèi)的ERα 發(fā)揮重要作用，ERα 由基因ESR1 編碼。ESR1 的多態(tài)性與SLE 的易感性顯著相關(guān)，并且雌激素的部分代謝物介導(dǎo)了SLE 風(fēng)險(xiǎn)的增加[10]。此外，ESR1 可以調(diào)節(jié)含三聯(lián)基序的蛋白21（tripartite motif-containing protein 21，TRIM-21）的表達(dá)，從而抑制SLE 中細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11]。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究來看，芹菜素對(duì)ESR1表現(xiàn)出良好的靶向作用，這可能是治療SLE 的機(jī)制之一，抑制ESR1 可能成為未來治療SLE 的新方向。

通路富集結(jié)果顯示，共富集到12 條通路，所有通路的P 值均小于0.05，其中最為顯著的是雌激素信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路。ESR1 和ESR2 編碼ERα 和ERβ 亞型，兩者不僅可以通過直接結(jié)合雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[11]。雌激素受體還可能與NF-κB 相互作用，引起DNA 上NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)NF-κB 依賴的基因轉(zhuǎn)錄。雌激素受體以細(xì)胞類型特異性調(diào)節(jié)NF-κB 介導(dǎo)的基因表達(dá)，并在炎癥過程中具有重要意義[12]。NF-κB 有助于骨髓中B 細(xì)胞和胸腺中T 細(xì)胞的成熟，在免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，但是B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的過度表達(dá)和失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致SLE[13]。此外，NF-κB 信號(hào)通路還與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路共同作用，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生理過程，因此芹菜素可能通過參與雌激素信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等多條通路在SLE 的治療中發(fā)揮作用。

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)，對(duì)雌激素信號(hào)通路和NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示芹菜素能夠抑制ERα，并且顯著抑制ERβ 和NF-κB 的轉(zhuǎn)錄。由于SLE 的發(fā)生較為復(fù)雜，轉(zhuǎn)錄活力的下降只是芹菜素治療SLE 活性的初步驗(yàn)證，對(duì)其他通路及下游炎癥因子的調(diào)控和表達(dá)的改善作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上可見，芹菜素作為解毒祛瘀滋陰方中的一個(gè)活性化合物，可以調(diào)控多個(gè)與SLE 發(fā)病相關(guān)的生物學(xué)過程，ALB、HSP90AA1、ESR1 是3 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控雌激素信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等12 條相關(guān)信號(hào)通路，為展開相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供了方向。