河北中醫(yī)學院

郭亞凈 任 靜 劉 寒 吉恩生△(石家莊 050200)

提要 目的：探討小續(xù)命湯對腦出血(ICH)小鼠腦組織中線粒體介導的細胞凋亡和自噬的作用及機制。方法：健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=12)：假手術組、ICH組、小續(xù)命湯治療組、小續(xù)命湯對照組。向ICH組和小續(xù)命湯治療組小鼠右側紋狀體內注入30 μL自體非抗凝血，建立ICH模型。假手術組和小續(xù)命湯對照組采用同樣的操作過程，但不注入血液。模型建立后，小續(xù)命湯治療組和小續(xù)命湯對照組給予小續(xù)命湯水煎液，連續(xù)灌胃1周后，收集腦組織標本。原位末端標記法(TUNEL)用于觀察細胞凋亡情況；免疫組織化學檢測用于觀察線粒體凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)和線粒體自噬相關蛋白Beclin-1、微管相關輕鏈蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Parkin、PINK-1的表達情況；Western blot用于檢測Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、NF-κB和p-NF-κB蛋白的表達情況。結果：與假手術組比較，ICH組TUNEL結果顯示小鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞數量顯著增多(P<0.001)，免疫組織化學檢測結果顯示Bax、cleaved-caspase-3、PINK-1表達顯著上調(P<0.05)，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.01)，Western blot結果顯示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達顯著上調(P<0.05，P<0.01)。與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組TUNEL結果顯示血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞的數量顯著減少(P<0.01)，免疫組織化學檢測結果顯示Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2、Bcl-2/Bax比值、Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK-1表達水平顯著上調(P<0.05，P<0.001)。Western blot結果顯示TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)。結論：小續(xù)命湯通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制ICH小鼠腦組織中的線粒體凋亡并促進線粒體自噬。

腦出血(ICH)指腦實質內的非創(chuàng)傷性出血，屬于中醫(yī)“中風”范疇。ICH約占腦血管疾病的15%，具有較高的病死率和致殘率，僅40%的幸存者可恢復正常[1]。ICH的不良預后歸因于血腫及其對大腦的機械壓迫所引起的原發(fā)性腦損傷和隨即出現的繼發(fā)性腦損傷[2]。然而，手術清除血腫不能顯著改善患者的預后，且缺乏有效改善繼發(fā)性腦損傷的醫(yī)療手段[3-4]。

小續(xù)命湯在現代臨床應用中治療急性缺血性中風及后遺癥療效顯著[5-6]。并且，小續(xù)命湯可以改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能缺損，減輕缺血性損傷[7]。然而，小續(xù)命湯在改善ICH后遺癥，縮短急性期療程方面也具有一定的優(yōu)勢。老中醫(yī)高允旺善用小續(xù)命湯治療急性ICH昏迷不醒，認為小續(xù)命湯為“治療ICH的金方”[5]。有證據表明，小續(xù)命湯可以抑制線粒體介導的細胞凋亡和自噬，從而改善ICH再灌注損傷[8-10]。并且，越來越多的臨床和臨床前證據表明，凋亡和自噬參與了ICH的病理生理過程[6, 11]。

本研究利用自體血注射小鼠ICH模型，研究小續(xù)命湯對ICH后血腫周圍腦組織中線粒體介導的細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料

1.1 動物 C57BL/6小鼠48只，8～10周齡，體質量約20～25 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：CSXK[京]2016-0006。本實驗經河北中醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準，編號DWLL20200068。

1.2 藥物與制劑 小續(xù)命湯由麻黃、防己、人參、黃芩、桂心、甘草、芍藥、川芎、杏仁、附子各9 g，防風12 g，生姜6 g組成，所用中藥均購于河北中醫(yī)學院國醫(yī)堂，經河北中醫(yī)學院中藥教研室鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》相關規(guī)定。將麻黃用2 L蒸餾水浸泡30 min后加熱，沸騰3次，去沫，然后將其余中藥放入水中，加熱至沸騰，繼續(xù)微沸煎煮至剩600 mL煎液，過濾煎液后再加1 L蒸餾水，煎煮至剩600 mL煎液，過濾。合并2次過濾后的煎液，加熱濃縮至含生藥質量濃度為1.62 g/mL的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(中國Servicebio公司，貨號GDP1042)；通用SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號SP-9002)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號ZLI-9017)；RIPA裂解液(中國Servicebio公司，貨號G2002)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Servicebio公司，貨號G2026)；Bcl-2抗體(中國Boster公司，貨號BA0412)；Bax抗體(中國Affinity公司，貨號AF0120)；活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗體(美國CST公司，貨號14220)；Beclin-1抗體(中國Biogot公司，貨號AP0768)；微管相關輕鏈蛋白3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)抗體(中國Affinity公司，貨號AF4650)；Parkin抗體(中國Boster公司，貨號PB9307)；PINK-1抗體(中國Affinity公司，貨號DF7742)；Toll樣受體4(TLR4)抗體(中國Servicebio公司，貨號GB11519)；髓樣分化因子88(MyD88)抗體(中國Boster公司，貨號BA2321)；NF-κB抗體(中國Affinity公司，貨號AF5006)；p-NF-κB抗體(中國Affinity公司，貨號AF2006)；β-actin抗體(中國Servicebio公司，貨號GB11001)；山羊抗兔IgG(中國Servicebio公司，貨號G1213)；ECL化學發(fā)光試劑盒(中國Servicebio公司，貨號G2014)。

1.4 主要設備 全自動腦立體定位儀(51700，stoelting公司，美國)；烘箱(UF160，MEMMERT公司，德國)；正置熒光顯微鏡(DM5000B，Leica公司，德國)；酶標儀(Varioskan LUX，Thermo Fisher公司，美國)；電泳儀(PowerPac Universal，Bio-Rad公司，美國)；半干轉印槽(Trans-BLot Smidry，Bio-Rad公司，美國)；多功能成像系統(tǒng)(Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法國)。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立方法 將C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=12)：假手術組、ICH組、小續(xù)命湯治療組、小續(xù)命湯對照組。參考相關文獻，建立ICH模型[12]。ICH組和小續(xù)命湯治療組小鼠，1%戊巴比妥鈉100 μL/g腹腔注射麻醉。待小鼠徹底麻醉后，將其固定于全自動腦立體定位儀上。剪去頭頂毛發(fā)，碘伏消毒，剪開頭部正中皮膚約0.5 cm，定位前囟，然后以前囟作為原點，向前0.5 mm，向右旁開2.3 mm，標記為穿刺點。用顱鉆垂直向下鉆開直徑約1 mm的小孔。剪斷尾尖，取30 μL自體非抗凝血至微量注射器中，用微量注射泵將微量注射器向下推進3.7 mm穿刺進入紋狀體，以2 μL/min的速度注入血液，注射結束后停留5 min，緩慢退針。骨蠟封閉小孔，縫合切口。假手術組和小續(xù)命湯對照組釆用同樣的麻醉及手術操作過程，但不注入血液。模型建立后，根據《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》計算出小鼠給藥劑量為16.2 g/(kg·d-1)。小續(xù)命湯治療組和小續(xù)命湯對照組給予小續(xù)命湯，假手術組和ICH組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃1周。

2.2 取材方法 給藥結束后，小鼠用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行灌流，將血管內的血液沖洗干凈。完整取出腦組織，去除小腦和腦干，僅留大腦。以血液注射進針點冠狀面為基準，分別向其前后延伸0.5 mm距離，切取厚約1 mm的腦組織，放入4%組織細胞固定液進行固定，隨后進行蠟塊包埋和切片，用于病理學檢測；用于Western blot檢測的腦組織僅留取患側紋狀體，液氮中存放24 h后，轉入-80 ℃冰箱備用。

2.3 原位末端標記法(TUNEL)染色 石蠟切片脫蠟至水后，用蛋白酶K進行修復。然后將玻片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加破膜工作，常溫下孵育20 min。PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加buffer，常溫孵育10 min后滴加反應液(TDT酶、dUTP和buffer按1∶5∶50比例混合)，放于濕盒內，37 ℃恒溫箱孵育2 h。切片用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。滴加DAPI復染細胞核，避光室溫孵育10 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干，用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用ImageJ軟件分析TUNEL陽性細胞數量。

2.4 免疫組織化學 石蠟切片脫蠟至水后，切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液中進行微波抗原修復。切片室溫冷卻后于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。然后，滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。在切片上滴加3% BSA，室溫封閉15 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS(pH7.4)按一定比例配好的一抗，置于濕盒內4 ℃孵育過夜。第2 d，將玻片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。切片置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。然后復染細胞核，脫水、透明后中性樹膠封片。切片于倒置顯微鏡下觀察并采集圖像，用ImageJ軟件分析。

2.5 Western blot 紋狀體腦組織內按一定比例加入RIPA裂解液提取蛋白。離心后，取上清，用BCA試劑盒測定蛋白質含量。將上清與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1∶4比例混勻后，于100 ℃進行蛋白變性5 min。隨后，將制備好的樣本進行上樣、電泳、轉膜和脫脂奶粉封閉，TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB和β-actin抗體用TBST按一定比例稀釋后，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。孵育HRP標記的二抗后，用ECL化學發(fā)光試劑盒來檢測蛋白表達。采用Image J軟件進行灰度值分析。以目的蛋白與β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相對表達量。用于觀察腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達及激活情況。

3 結果

3.1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性細胞數量的影響 與假手術組比較，ICH組小鼠腦組織TUNEL陽性細胞數量顯著增加(P<0.001)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中TUNEL陽性細胞數量顯著減少(P<0.01)。見圖1。

注：A.假手術組；B.ICH組；C.小續(xù)命湯治療組；D.小續(xù)命湯對照組(圖2～圖4同)；與假手術組比較，*** P<0.001；與ICH組比較，## P<0.01。圖1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中凋亡細胞數量的影響(TUNEL，×400)

3.2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響 與假手術組比較，ICH組小鼠腦組織中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)，Bax和cleaved-caspase-3顯著升高(P<0.05)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Bcl-2和Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，Bax和cleaved-caspase-3顯著降低(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表1 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

3.3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響 與假手術組比較，ICH組小鼠腦組織中PINK1表達顯著升高(P<0.05)，而Beclin-1、LC3-Ⅱ和Parkin表達雖有升高，但差異無顯著性(P>0.05)；小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表達均顯著升高(P<0.05，P<0.001)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中Parkin和PINK1表達顯著升高(P<0.05)，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達雖有升高，但差異無顯著性(P﹥0.05)。見圖3、表2。

圖3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表2 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1蛋白表達的影響

3.4 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達的影響 與假手術組比較，ICH組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與ICH組比較，小續(xù)命湯治療組小鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見圖4、表3。

圖4 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達的影響

表3 小續(xù)命湯對ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白相對表達水平的影響

4 討論

小續(xù)命湯為唐代治療中風第一要方。由于對中風病機的認識由“外風”轉變?yōu)椤皟蕊L”，小續(xù)命湯在金元及其后期逐漸不被主流醫(yī)家認可。隨著國家對中醫(yī)藥傳承工作的重視，古代經典名方的臨床價值再次受到醫(yī)家及學者們的關注，小續(xù)命湯也被重新提及。

中風包括現代醫(yī)學中的腦梗死、ICH、短暫性腦缺血發(fā)作等腦血管疾病。小續(xù)命湯可以提高中風恢復期患者的生活能力，改善其生活質量[13-14]。

臨床觀察發(fā)現，小續(xù)命湯聯合西醫(yī)治療可以縮小ICH病人的血腫體積，減輕患者神經損傷、肢體功能障礙等后遺癥[15-17]。實驗研究顯示，小續(xù)命湯可以縮小ICH大鼠的血腫體積，改善局部腦血流、降低脂質過氧化物的活性，阻止細胞外Ca2+內流以控制、減輕腦水腫[18-19]。然而，小續(xù)命湯發(fā)揮ICH治療作用的機制有待進一步研究。

細胞凋亡參與多種腦血管疾病的病理過程，與ICH后血腫周圍組織的神經元丟失密切相關[6]?？沟蛲龅鞍譈cl-2表達減少或促凋亡蛋白Bax表達增多均可導致細胞凋亡增強。Bcl-2/Bax比值穩(wěn)定在一定水平，可維持膜電位，防止線粒體凋亡途經重要信號蛋白細胞色素C釋放入細胞質中而引起凋亡。Cleaved-caspase-3則是細胞凋亡進入不可逆階段的標志。研究發(fā)現，小續(xù)命湯有效成分可以升高慢性腦缺血大鼠腦組織中的線粒體膜電位，減少細胞色素C釋放，升高Bcl-2/Bax比值，抑制caspase誘導的下游級聯，從而減輕神經元凋亡[8, 20]。筆者的研究結果顯示，小續(xù)命湯顯著減少了ICH小鼠血腫周圍TUNEL陽性細胞的數量，增加了腦組織中Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax比值，降低了Bax和cleaved-caspase-3的表達。結果表明，小續(xù)命湯抑制了ICH小鼠血腫周圍組織的細胞凋亡。

自噬與ICH病人和實驗動物的神經元損傷相關，抑制線粒體自噬可以減輕ICH后的繼發(fā)性腦損傷[21]。Beclin-1是自噬引發(fā)階段的關鍵調控因子[22]。當線粒體受到去極化刺激后，觸發(fā)PINK1/Parkin通路調控的線粒體自噬，泛素化的線粒體蛋白與LC3-Ⅱ共同形成自噬小體[23]。Lan等發(fā)現小續(xù)命湯通過下調自噬基因LC3、Beclin-1、Lamp1和線粒體P62的表達來抑制線粒體自噬，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經保護作用[10]。而筆者的研究結果顯示，小續(xù)命湯顯著增加了ICH小鼠血腫周圍腦組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ、Parkin和PINK1表達。結果表明，小續(xù)命湯促進ICH小鼠血腫周圍腦組織中的線粒體自噬。筆者推測這種相反的研究結果，可能與ICH后不同時間段的病理生理特征有關，此時增強線粒體自噬，可以通過清除老化的胞內細胞器和錯誤折疊的蛋白質，保護細胞免受缺血和缺氧等刺激。

TLR4被激活后可以通過MyD88依賴和非依賴兩條途徑激活NF-κB，從而產生生物學效應[24]。抑制或阻斷TLR4/MyD88/NF-κB通路，可以使胞漿中細胞色素C水平升高，線粒體中細胞色素C水平降低，降低cleaved-caspase-3表達，從而抑制細胞的線粒體凋亡[25-26]。并且，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，也可以抑制線粒體自噬[27]。吳海洋等研究發(fā)現，小續(xù)命湯聯合超早期針刺督脈可以顯著改善腦缺血再灌注模型大鼠神經功能缺損情況并抑制自噬相關蛋白NF-κB p65活性，保護腦功能[28]。另外，體外和在體實驗均顯示，小續(xù)命湯可以降低小膠質細胞TLR4和MyD88的表達[29]。同樣，筆者的研究結果顯示，小續(xù)命湯降低了ICH小鼠血腫周圍腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB 和p-NF-κB的表達。

綜上所述，小續(xù)命湯抑制了ICH小鼠血腫周圍腦組織中的細胞凋亡，促進了線粒體自噬，這可能與其對TLR4/MyD88/NF-κB通路的調控作用相關。進一步完善了小續(xù)命湯治療ICH的作用機制。