河北中醫(yī)學(xué)院

張 闖 劉衛(wèi)哲 董倩波△ 劉興超 楊洪霞 孫佳歡 李 斯 李愛英(石家莊 050091)

提要 目的：建立尖葉假龍膽高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜并同時(shí)測(cè)定其中8種成分含量測(cè)定方法。方法：本方法采用HPLC，色譜柱為Waters XBridge C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，同時(shí)測(cè)定18批尖葉假龍膽組指紋圖譜及8種成分含量。結(jié)果：18批尖葉假龍膽指紋圖譜相似度大于0.990，標(biāo)定了20個(gè)共有峰并測(cè)定了8種成分含量。結(jié)論：多成分含量測(cè)定方法以及指紋圖譜方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可為尖葉假龍膽質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

中藥指紋圖譜可以體現(xiàn)藥材中已知成分或未知成分的分布情況，具有整體性、特征性等特點(diǎn)，能夠較為全面地反映中藥所含化學(xué)成分的相對(duì)關(guān)系，同時(shí)提供豐富的鑒別信息，真正全面地表征藥材內(nèi)在質(zhì)量[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)建立尖葉假龍膽高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜，同時(shí)測(cè)定尖葉假龍膽中8種活性成分的含量，以期完善尖葉假龍膽的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、UV-9000紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、SQP型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)。

1.2 試劑 龍膽苦苷(批號(hào)：J0316AS)、芒果苷(批號(hào)：N0213AS)對(duì)照品購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，異牡荊素(批號(hào)：No.524B021)、木犀草素(批號(hào)：4773-96-0)對(duì)照品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，去甲基雛菊葉龍膽酮(批號(hào)：Z08M8S30830)、雛菊葉龍膽酮(批號(hào)：Z10M8B30943)對(duì)照品，均購(gòu)于南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司，去甲當(dāng)藥醇苷和當(dāng)藥醇苷由實(shí)驗(yàn)室自制，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，可供含量測(cè)定用。乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，超純水為實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水機(jī)自制。

1.3 藥材 藥材樣品于2014年至2019年在內(nèi)蒙古、黑龍江、寧夏每年采集1次，共18批，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定與炮制教研室鑒定為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽(Gentianellaacuta)，樣品信息詳見表1。

表1 尖葉假龍膽藥材樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫：0～10 min，5%～5%乙腈；10～20 min，5%～10%乙腈；20～30 min，10%～20%乙腈；30～ 35 min, 20%～30%乙腈；35～45 min，30%～50%乙腈；45～50 min，50%～60%乙腈；50～60 min，60%～60%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 供試品溶液的制備 取尖葉假龍膽樣品適量，精密稱取0.10 g，倒入50 mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇溶劑50 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取8種標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入10 mL量瓶中，用甲醇配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為龍膽苦苷46.40 mg/L、芒果苷45.01 mg/L、去甲當(dāng)藥醇苷15.03 mg/L、異牡荊素63.78 mg/L、當(dāng)藥醇苷55.05 mg/L、木犀草素41.26 mg/L、去甲基雛菊葉龍膽酮36.30 mg/L和雛菊葉龍膽酮38.80 mg/L混合對(duì)照品溶液，搖勻，放于4 ℃冰箱中保存，以備使用。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗(yàn)：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以分離度較好且峰面積較大的雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2.21%，相對(duì)峰面積的RSD<1.78%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄6份尖葉假龍膽樣品色譜圖，以雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2.15%，相對(duì)峰面積的RSD<1.89%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，分別在制備后的0、2、4、8、12、24、48 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2.07%，相對(duì)峰面積的RSD<1.66%，說明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 尖葉假龍膽指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)：取收集的18批尖葉假龍膽，按“2.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備尖葉假龍膽供試品溶液(S1～S18)，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)。將所得18批樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)”進(jìn)行分析，以S1為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，得到尖葉假龍膽指紋圖譜共有模式及對(duì)照指紋圖譜，結(jié)果見圖1。經(jīng)匹配后標(biāo)定了尖葉假龍膽樣品指紋圖譜中20個(gè)共有峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<2.0%，以生成的尖葉假龍膽對(duì)照指紋圖譜為參照，對(duì)18批尖葉假龍膽色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S1～S18相似度均≥0.990。

圖1 18批尖葉假龍膽的HPLC指紋圖譜疊加圖

2.4.5 指紋圖譜共有峰的指認(rèn)與歸屬：通過與混合對(duì)照品比對(duì)，確定20個(gè)共有峰中，4號(hào)峰為龍膽苦苷，5號(hào)峰為芒果苷，8號(hào)峰為去甲當(dāng)藥醇苷，10號(hào)峰為異牡荊素，13號(hào)峰為當(dāng)藥醇苷，15號(hào)峰為木犀草素，17號(hào)峰為去甲基雛菊葉龍膽酮，20號(hào)峰為雛菊葉龍膽酮，混合對(duì)照品及尖葉假龍膽樣品的HPLC色譜圖見圖1。

2.5 尖葉假龍膽中8種成分含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件及供試品溶液、混合對(duì)照品溶液的制備：同“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下方法。尖葉假龍膽8種混合對(duì)照品與藥材色譜圖見圖2。

注：1.龍膽苦苷;2.芒果苷;3.去甲當(dāng)藥醇苷;4.異牡荊素;5.當(dāng)藥醇;6.木犀草素;7.去甲基雛菊葉龍膽酮;8.雛菊葉龍膽酮。圖2 尖葉假龍膽混合對(duì)照品(A)和尖葉假龍膽樣品(B)的HPLC色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察：按“2.3”項(xiàng)下方法制備的龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的混合對(duì)照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高質(zhì)量濃度。按照倍比稀釋法，制備不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到8種對(duì)照品的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果詳見表2。結(jié)果表明龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表2 8種成分線性關(guān)系考察結(jié)果 (mg/L)

2.5.3 精密度試驗(yàn)：取尖葉假龍膽供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮面積的RSD值分別為0.12%、0.45%、1.37%、0.91%、1.46%、0.83%、0.51%、0.79%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批尖葉假龍膽供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.77%、1.01%、0.88%、1.83%、0.59%、1.40%、0.91%、1.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取尖葉假龍膽供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮峰面積的RSD值分別為0.45%、0.62%、1.20%、1.52%、0.62%、1.37%、0.79%、1.07%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)：取同一批尖葉假龍膽樣品(S1)0.1 g，精密稱定6份，置100 mL量瓶中，分別加入各對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的平均加樣回收率分別為101.42%、100.66%、101.26%、101.74%、100.59%、99.37%、101.32%、99.90%，RSD值分別為0.93%、0.76%、1.33%、2.36%、1.26%、1.74%、0.84%、1.16%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 樣品測(cè)定：制備18批尖葉假龍膽樣品的供試品溶液(S1～S18)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中8種成分的含量，結(jié)果詳見表3。18批尖葉假龍膽中，龍膽苦苷、芒果苷、去甲當(dāng)藥醇苷、異牡荊素、當(dāng)藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.45～1.68、1.14～1.27、12.88～13.75、0.10～0.13、9.84～10.42、0.44～0.56、12.58～13.03 、15.80～16.98 mg/g，其中去甲當(dāng)藥醇苷、當(dāng)藥醇苷、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮含量較高，異牡荊素和木犀草素含量較少。

表3 18批尖葉假龍膽藥材中8種成分含量 (mg/g, n=3)

3 討論

綜上，本研究采用HPLC法建立了尖葉假龍膽指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定8種成分的含量。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，有效地反映了尖葉假龍膽的定性特征和定量信息，為其全面質(zhì)量控制提供了方法。