王璐璐，甘昌冉，韋馨琳，胡婧怡，朱 蓉，秦貞苗

(海南醫(yī)學院藥學院，海南 ?？?571199)

滴眼液是治療眼部疾病最方便、安全并且病人依從性最好的無創(chuàng)式眼用制劑[1]。但由于角膜屏障和淚液沖刷，滴眼給藥后基本只有5%的藥物能夠到達內(nèi)眼病灶部位[2]，生物利用度低，需要通過頻繁高濃度給藥才能發(fā)揮治療作用，但大量藥物流失進入循環(huán)系統(tǒng)，易產(chǎn)生全身不良反應。因此尋求能提高藥物生物利用度或使藥物緩慢釋放的眼部給藥制劑尤為重要。納米粒(Nanoparticles，NPs)是一種常用的納米遞藥載體，能實現(xiàn)對難溶性藥物的包載和輸送，控制藥物釋放速度，延長藥物在角膜的滯留時間，提高藥物的眼部生物利用度[3-4]。

葛根素(Puerarin，Pue)是從豆科植物野葛PuerariathunbergianaBenth.根中提取的一種黃酮苷類化合物[5]，具有擴張血管，降低眼壓，改善微循環(huán)等作用[6]。目前市售的葛根素滴眼液主要用于青光眼的治療，但是患者滴眼后由于不斷眨眼活動導致藥液大量流失，治療效果顯著降低[7]。本文以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-coglycolic acid，PLGA)為載體材料，結(jié)合單因素和正交設計試驗考察Pue-PLGA NPs最優(yōu)制備工藝，并對其進行初步的質(zhì)量評價，以期為葛根素新型眼用制劑的開發(fā)奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Scientz-IID型超聲波細胞粉碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；Delsa Nano C型納米粒度/ζ電位分析儀,美國Beckman Coulter公司；Micro 21R型臺式冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SN-MS-3D型三聯(lián)磁力攪拌器,上海尚儀儀器設備有限公司；AX224ZH型電子天平,奧豪斯(常州)儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器,上海精科實業(yè)有限公司。

葛根素原料藥(純度≥98%),陜西林洲生物科技有限公司；葛根素對照品(純度≥99%),中檢所；1%葛根素滴眼液，浙江平湖莎普愛斯制藥廠；PLGA(MW=20000，LA/GA=75/25)，濟南岱罡生物技術有限公司；聚乙烯醇(PVA，0588低粘度型)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；2-羥基-β-環(huán)糊精(2-HP-β-CD)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；超濾管(0.5 mL，3KD)，密理博；甲醇為色譜純，美國BCR公司；其他試劑均為分析純。

1.2 Pue-PLGA NPs的制備

采用改良乳化溶劑揮發(fā)法[8]制備Pue-PLGA NPs。精密稱取處方量葛根素和PLGA溶于適量乙醇-二氯甲烷(2:3)混合溶液中，形成有機相，另配制PVA和2-HP-β-CD混合溶液為水相，將有機相用注射器緩慢加入到水相中，冰浴下間斷超聲20 min(功率200 W，工作2 s，間隔2 s)，形成初乳，繼續(xù)磁力攪拌15 h，揮去有機溶劑，適量雙蒸水定容，調(diào)節(jié)pH在7.0～7.5之間，即得Pue-PLGA NPs。同法制得不含Pue的空白PLGA NPs。

1.3 Pue-PLGA NPs中葛根素含量測定方法的建立

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-水(25:75);檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2 溶液配制

對照品溶液：精密稱取葛根素對照品10 mg置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為400 μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：精密量取Pue-PLGA NPs 1 mL置10 mL容量瓶中，加1 mL乙腈超聲破乳，使用流動相稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

空白溶液：取適量PLGA NPs，同“供試品溶液”法制備空白溶液。

1.3.3 專屬性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液和空白溶液按“1.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(圖1)，可見葛根素與基質(zhì)成分分離情況良好，處方中的輔料對樣品測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

1.3.4 線性關系

精密量取葛根素對照品溶液適量，分別配制成濃度為20、40、60、80、100、120和140 μg/mL的系列標準溶液，用0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，按“1.3.1”項下色譜條件測定。以葛根素濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為A=0.731C-0.9245，r=0.9994。結(jié)果表明葛根素在20～120 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系(圖2)。

圖2 葛根素對照品溶液標準曲線Fig.2 Calibration curve of puerarin reference solution

1.3.5 精密度試驗

取“1.3.4”項下40 μg/mL的對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值為0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

1.3.6 重復性試驗

精密量取同一批制備的Pue-PLGA NPs 1 mL，按“1.3.2”項下的供試品溶液操作，平行制備供試品溶液6份，在“1.3.1”項下色譜條件測定。結(jié)果測得Pue-PLGA NPs中葛根素的平均含量為987.6 μg·mL-1，RSD值為2.77%，表明方法重現(xiàn)性良好。

1.3.7 回收率試驗

精密量取“1.3.2”項下的對照品溶液1.0 mL、1.25 mL、1.5 mL各3份置于10mL容量瓶中，分別加入空白PLGA納米粒溶液0.5 mL，按“1.3.2”項下制備供試品溶液，在“1.3.1”項下色譜條件進樣測定，測得平均回收率為95.72%，RSD值為1.93%(n=9)。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗

取“1.3.6”項下供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h在“1.3.1”項下色譜條件測定，測得峰面積RSD值為1.78%，表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4 Pue-PLGA NPs包封率的測定

采用超濾離心法測定Pue-PLGA NPs的包封率。

精密量取“1.3.2”項下的對照品溶液1.0 mL、1.25 mL、1.5 mL各3份置于2 mL容量瓶中，分別加入空白PLGA納米粒溶液0.5 mL，加水定容至刻度。精密量取0.4 mL置超濾管中，10000 rpm保持4 ℃離心30 min，精密量取接收管離心液體0.3 mL置1 mL容量瓶中，加流動相稀釋定容，在“1.3.1”項下色譜條件進樣測定葛根素含量，計算回收率。結(jié)果表明低、中、高不同含量的葛根素溶液加入到空白PLGA納米粒溶液中后，回收率分別為98.38%、97.91%和101.46%，平均RDS值為1.27%，說明超濾法可有效分離納米粒中的游離藥物，可用于包封率的測定。

精密量取Pue-PLGA NPs 0.4 mL置超濾管中，10000 rpm保持4 ℃離心30 min，精密量取接收管離心液體0.3 mL置1 mL容量瓶中，加流動相稀釋定容，在“1.3.1”項下色譜條件進樣測定游離藥物的含量M游離。按“1.3.2”項下制備供試品溶液過濾進樣，測定Pue-PLGA NPs滴眼液中總的藥物含量M總。按公式包封率EE=[(M總-M游離)/M總]×100%計算Pue-PLGA NPs的包封率。

1.5 Pue-PLGA NPs粒徑的測定

取適量Pue-PLGA NPs用去離子水稀釋10倍，用激光粒度測定儀測定Pue-PLGA NPs滴眼液的平均粒徑和分布。

1.6 Pue-PLGA NPs處方工藝單因素考察

以粒徑、包封率為評價指標，采用單因素實驗考察油水比例、PVA濃度、PLGA濃度、藥物濃度、超聲時間、攪拌揮發(fā)時間等6個因素對Pue-PLGA NPs的影響(表1，實驗中考察主要因素時其余因素全部選擇水平3)。

表1 單因素試驗表Table 1 Single factor test table

1.7 Pue-PLGA NPs正交試驗

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal factor level table

在單因素實驗的基礎上，選取對Pue-PLGA NPs制備影響較大的3個因素：乳化劑濃度、PLGA濃度、超聲時間，每個因素選擇3個水平，按L9(34)正交表設計進行實驗(表2)。以粒徑和包封率為評價指標，采用綜合加權評分法[9]對試驗結(jié)果進行分析，粒徑和包封率權重系數(shù)分別為0.4和0.6，按下面公式計算綜合評分，并對試驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 處方工藝單因素條件對Pue-PLGA NPs的影響

2.1.1 油水比例的考察

固定水相體積不變，改變油相體積進行處方篩選，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，隨著油相用量的減小，納米粒粒徑先減小后增大，包封率先增大后減小。這是因為隨著油相用量的減小，油相在水相中可以充分分散，形成粒徑更小、更多的納米粒[10]；但是隨著油相用量繼續(xù)減小，一方面分散到水相的量減少后引起體系黏度增加，粒子聚集[11]，另一方面油相溶解的藥物和PLGA用量也減小，因此使得粒徑增大，包封率下降。

圖3 油水比例對納米粒粒徑和包封率的影響Fig.3 Effect of oil phase/aqueous phase volume ratio on nanoparticle size and entrapment efficiency

2.1.2 PVA濃度的考察

分別采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%不同質(zhì)量濃度的PVA溶液進行處方篩選，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，隨著PVA質(zhì)量濃度的增大，納米粒的粒徑逐漸增大，包封率變化不大。這是因為乳化劑用量增大時，體系的黏度增加[12]，粒子間發(fā)生黏連聚集，形成的顆粒逐漸增大。

圖4 PVA濃度對納米粒粒徑和包封率的影響Fig.4 Effect of PVA concentration on nanoparticle size and entrapment efficiency

2.1.3 PLGA濃度的考察

分別采用1、2、4、6、8 mg·mL-1不同質(zhì)量濃度的PLGA進行處方篩選，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，隨著PLGA質(zhì)量濃度的增大，納米粒粒徑和包封率逐漸增大。這是因為PLGA用量增大后，有機相的黏度增加，不易在水相中分散均勻[10]，形成的納米粒粒徑逐漸增大；同時，PLGA用量增大，包封的藥物增加，包封率也逐漸增加。

圖5 PLGA濃度對納米粒粒徑和包封率的影響Fig.5 Effect of PLGA concentration on nanoparticle size and entrapment efficiency

2.1.4 藥物濃度的考察

分別采用0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1不同質(zhì)量濃度的藥物進行處方篩選，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，納米粒粒徑未見明顯變化，包封率先增大后減小。這是因為藥物濃度較少時，乳化劑的增溶作用使部分藥物溶解到水相中，包封率較小。隨著藥物濃度的增加，乳化劑增溶作用減弱，包封率逐漸增加。但當藥物濃度過大時，在PLGA不變的情況下，導致藥物包封不完全，包封率下降。

圖6 藥物濃度對納米粒粒徑和包封率的影響Fig.6 Effect of drugconcentration on nanoparticle size and entrapment efficiency

2.1.5 超聲時間的考察

分別采用5、10、15、20、25 min不同超聲時間進行處方篩選，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，隨著超聲時間的增加，納米粒粒徑逐漸減小，包封率先增大后減小。這是因為延長超聲時間，有機相在水相中能充分乳化分散，生成的納米粒較多、粒徑較小。但當超聲時間過長時，溫度升高，影響藥物和體系的穩(wěn)定性。

圖7 藥物濃度對納米粒粒徑和包封率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on nanoparticle size and entrapment efficiency

2.2 正交試驗設計對處方及制備工藝的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，選取對Pue-PLGA NPs制備影響較大的3個因素：乳化劑濃度、PLGA濃度、超聲時間，每個因素選擇3個水平制備9批納米粒。從直觀分析結(jié)果(表3)可知，影響Pue-PLGA NPs制備的因素主次順序為C(超聲時間)>A(PVA濃度)>C(PLGA濃度)，最優(yōu)處方為A1B2C3，即PVA濃度為1.0%，PLGA濃度為4 mg·mL-1，超聲時間為20 min；從方差分析結(jié)果(表4)可知，PVA濃度和超聲時間對納米粒的制備影響顯著，PLGA濃度對納米粒制備無顯著性影響。

表3 正交實驗設計和結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.3 Pue-PLGA NPs處方工藝驗證

按最優(yōu)處方制備3批Pue-PLGA NPs，測得平均粒徑為(141.4±2.4)nm，平均包封率為(71.31±0.57)%，批間重復性好，處方工藝穩(wěn)定。

2.4 Pue-PLGA NPs的表征

2.4.1 形態(tài)觀察

圖8 Pue-PLGA NPs透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron microscopic image of Pue-PLGA NPs

取少量Pue-PLGA NPs加水稀釋后，置于銅網(wǎng)上，固定10 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干多余的溶液，室溫過夜自然晾干，置于透射電鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)果見圖8。由圖8中可見制得的Pue-PLGA NPs呈球型，大小及分布均勻，粒子間無明顯黏連。

2.4.2 粒徑分布及Zeta電位

取少量Pue-PLGA NPs加水稀釋后，于激光粒度測定儀測定其粒徑分布和Zeta電位，結(jié)果見圖9和圖10。圖9和圖10可見納米粒粒徑呈分布均勻，平均粒徑為(149.2±4.8)nm，PDI 為0.111±0.05，Zeta電位為-(5.73±0.12)mV。表明Pue-PLGA NPs體系較穩(wěn)定，粒子不易發(fā)生聚集，與透射電鏡觀察結(jié)果一致。

圖9 Pue-PLGA NPs粒徑分布Fig.9 Particle size distribution of Pue-PLGA NPs

圖10 Pue-PLGA NPs Zeta電位Fig.10 Zeta potential of Pue-PLGA NPs

3 結(jié) 論

本文以PLGA為載體材料，采用改良的乳化溶劑揮發(fā)法制備Pue-PLGA NPs。PLGA是由丙交酯LA和乙交酯GA開環(huán)無規(guī)共聚合得到的，作為藥物載體材料具有生物可降解的優(yōu)點，同時能控制藥物的釋放速率，顯著提高藥物的生物利用度[13]。在實驗中發(fā)現(xiàn)當使用乙醇：二氯甲烷有機溶劑混合液的比例為3:2時，PLGA不能完全溶解，當改為乙醇:二氯甲烷(2:3)時，PLGA則可以完全溶解，而且酯封端的PLGA比酸封端的PLGA測得的包封率高，說明乙醇對PLGA的溶解度不高，Pue是脂溶性藥物，更容易和酯封端的PLGA產(chǎn)生吸附作用。

粒徑和包封率是載藥納米粒制備工藝的2個重要評價指標。研究發(fā)現(xiàn)，微粒粒徑小于200 nm時，能增加藥物透過角膜的量，藥物多分布于視網(wǎng)膜；但微粒粒徑小于20 nm時，只有極少量到達視網(wǎng)膜，這主要原因是微粒過小時易在眼周循環(huán)過程中清除[14-15]。另外，粒徑大小是影響納米制劑釋放的主要因素，當粒徑為納米范圍時能延長藥物釋放的時間，達到緩釋的效果。本實驗考察了低速離心法、透析法和超濾法測定納米粒包封率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超濾法能有效分離納米粒和游離藥物，測得的包封率數(shù)值差異小，回收率高；對于低速離心法，在5000 r·min-1條件下離心30 min，上清液透鏡結(jié)果顯示仍有游離藥物晶體存在，而且包封率測定結(jié)果平行性不好；對于透析法，在100 r·min-1，37 ℃氣浴恒溫振蕩，隨著振蕩時間的增加，PLGA容易降解，導致納米粒發(fā)生藥物泄露，測得的包封率偏低。

本研究初步優(yōu)化了Pue-PLGA NPs的處方工藝，制得的納米粒粒徑適宜、分布均勻，包封率較高，形態(tài)呈球形，體系穩(wěn)定，為進一步考察其角膜滲透性和藥動學特征提供實驗基礎。