陳 凱，卿 晶，代德勝，王春玲，魏翠雯，沈桂富

(深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東 深圳 518057)

呼氣試驗是指通過測定呼氣成分呼氣中的標(biāo)志氣體，實(shí)現(xiàn)對身體狀態(tài)的非侵入性診斷。呼氣試驗操作簡單、容易被受檢者接收，研究非?；钴S[1]。目前多項呼氣試驗技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于臨床診斷，如13C-螺旋藻診斷胃排空功能障礙[2]、13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染[3-4]和一氧化氮呼氣檢測哮喘[5]。其中13/14C-尿素呼氣試驗診斷幽門螺桿菌感染在臨床應(yīng)用中頗受歡迎，已經(jīng)成為呼吸內(nèi)科臨床診斷幽門螺桿菌感染的主流方案。

肝臟擔(dān)負(fù)著多種重要的生化功能，是人體最重要的代謝器官之一，肝功能準(zhǔn)確性測定有重要的臨床意義。目前常用的檢測方法包括藥物動力學(xué)試驗、血液生化檢查等。鑒于13/14C-尿素呼氣試驗在市場推廣中取得了巨大的成功，13C-標(biāo)記化合物呼氣試驗檢測肝功能成為一個新的研究熱點(diǎn)。在目前報道研究中，科研工作者試驗了多種標(biāo)記化合物，例如：美沙西汀-甲氧基-13C[6-7]、13C-氨基比林[8]、L-[1-13C]-苯丙氨酸[9]等，其中美沙西汀-甲氧基-13C較其他的標(biāo)記化合物具有用量小、代謝快、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，是研究最活躍的肝功能呼氣試驗底物。鑒于美沙西汀-甲氧基-13C呼氣試驗的特點(diǎn)，近些年關(guān)于美沙西汀-甲氧基-13C檢測肝功能的臨床實(shí)驗和研究論文日趨增多，多項臨床實(shí)驗處于臨床Ⅱ期和臨床Ⅲ期。

本研究旨在研究以甲醇-13C為標(biāo)記試劑合成美沙西汀-甲氧基-13C的工藝路線參數(shù)。本文以Williamson反應(yīng)作為關(guān)鍵反應(yīng)，配合簡單的官能團(tuán)轉(zhuǎn)化高效合成了美沙西汀-甲氧基-13C。該合成路線標(biāo)記產(chǎn)物純度高，同位素標(biāo)記試劑甲醇-13C利用率高，是一種合成美沙西汀-甲氧基-13C的工藝化方案。

1 實(shí) 驗

1.1 儀器與試劑

儀器：XPE303S型電子天平,梅特勒-托利多；MS7-H550-Pro數(shù)顯加熱磁力攪拌器,大龍興創(chuàng)實(shí)驗儀器股份公司；機(jī)械攪拌,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；SHK-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵,鄭州科泰實(shí)驗設(shè)備有限公司；EYELA東京理化旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1300系列,東京理化器械株式會社；HB-20耐腐蝕隔膜真空泵,上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司；核磁共振氫譜,布魯克400 M核磁AVANCE-Ⅲ；檢測和高分辨質(zhì)譜,賽默飛高分辨質(zhì)譜Q Exactive Focus。

試劑：對乙酰氨基酚(純度>98%),碳酸鉀(純度>98%)，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；甲醇-13C(純度>98%，同位素豐度為99atom%13C)、美沙西汀-甲氧基-13C(純度98.7%，同位素豐度為99atom%13C),劍橋同位素實(shí)驗室;所有溶劑均為市售化學(xué)純或分析純試劑，不經(jīng)處理直接使用。

1.2 試驗步驟

將紅磷(50 g，1.61 mol)、水(100 mL)投入到帶回流裝置的反應(yīng)器中，冷卻至-15 ℃，緩慢加入碘(250 g，1 mol)。在-15 ℃條件下緩慢加入甲醇-13C(40.5 mL，1 mol)，將反應(yīng)體系升溫至回流，反應(yīng)2 h。冷卻反應(yīng)體系，將反應(yīng)裝置更換為蒸餾裝置，收集45 ℃左右的冷凝液。

將對乙酰氨基酚(151.0 g，1 mol)溶解于1 L乙腈中，加入碳酸鉀(276 g，2 mol)，用機(jī)械攪拌攪拌60 min，將上一步驟蒸餾得到的產(chǎn)物緩慢加入反應(yīng)體系，在35 ℃攪拌12 h。靜置反應(yīng)液，過濾，用乙腈洗滌濾餅。收集濾液后，向濾液中加入100 mL氫氧化鈉水溶液(含量為10%)，攪拌10 min后分液。濾液旋干后得到的固體在75 ℃用乙醇溶解，體系恢復(fù)室溫后用在2～8 ℃放置6 h，過濾得到白色晶體，烘干后稱重，計算收率。

1.3 產(chǎn)物表征

產(chǎn)物美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜如下：1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.02 (s, 1H), 7.60～7.45 (m, 2H), 6.92～6.75 (m, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.03 (s, 3H)。美沙西汀-甲氧基-13C的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)為ESI-MS: [M+H]+=167.0896，[M+Na]+=189.0716。合成樣品的核磁共振氫譜和高分辨質(zhì)譜均與劍橋同位素實(shí)驗室購買的對照品一致。核磁共振氫譜顯示由于碳13的自旋量子數(shù)為1/2，美沙西汀-甲氧基-13C中甲氧基上的三個峰被裂分為d峰。

圖1 美沙西汀-甲氧基-13C的核磁共振氫譜Fig.1 1H-NMR of methacetin-methoxy-13C

本文以從劍橋同位素實(shí)驗室的美沙西汀-甲氧基-13C樣品(含量為98.7%)作為對照品。通過分析對照品和合成樣品的高效液相數(shù)據(jù)，推算出合成樣品的含量為99.3%。經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測美沙西汀-甲氧基-13C合成樣品的同位素豐度為99.2atom%13C，相對于標(biāo)記原料豐度未發(fā)生明顯降低。

2 結(jié)果與討論

2.1 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線

圖2 美沙西汀-甲氧基-13C的合成路線Fig.2 Synthetic route of methacetin-methoxy-13C

美沙西汀-甲氧基-13C合成最大的難點(diǎn)是如何活化甲醇-13C中的碳氧鍵，文獻(xiàn)調(diào)研顯示可首先將甲醇-13C中的碳氧鍵轉(zhuǎn)化為碳鹵鍵，然后利用Williamson反應(yīng)合成美沙西汀-甲氧基-13C。Williamson合成醚鍵時伯鹵代烷是效果最佳反應(yīng)底物，對于一般的烷基醇，反應(yīng)需要使用強(qiáng)堿，比如NaH、LDA等，而對于酸性較強(qiáng)的酚羥基，使用碳酸鉀或者碳酸銫即可。第一步甲醇羥基碘化反應(yīng)，可使用碘化鉀、磷酸將甲醇-13C中的羥基碘化，該方法雖條件溫和，但收率不高。因此本文嘗試使用紅磷、碘將甲醇-13C中的羥基碘化，該方法在操作的時候控制好溫度和加料速度，可得到較高收率。接下來本文重點(diǎn)篩選了Williamson的反應(yīng)條件。

2.2 Williamson反應(yīng)溶劑的篩選

本文篩選了Williamson反應(yīng)的反應(yīng)溶劑。從表一(反應(yīng)規(guī)模為10 mmol，收率以甲醇-13C作為起始物計算)可以發(fā)現(xiàn)丙酮和乙腈作為溶劑時反應(yīng)效果更好，反應(yīng)總體收率較高(氮氮二甲基甲酰胺也是一種效果好反應(yīng)溶劑，但由于該溶劑沸點(diǎn)高，最后完全去除的難度較大不利于產(chǎn)物的純化，本實(shí)驗沒有進(jìn)行嘗試)，常用的乙酸乙酯和二氯甲烷作為溶劑時收率低。丙酮和乙腈的效果均較好，但考慮到丙酮為管制試劑，實(shí)驗溶劑本文選用了乙腈。

表1 溶劑對反應(yīng)收率的影響Table 1 Effect of solvent on reaction yield

2.3 Williamson反應(yīng)溫度的篩選

確定了Williamson反應(yīng)的溶劑之后，本文考察了溫度對于合成反應(yīng)的影響。考慮到碘甲烷的沸點(diǎn)僅有42.5 ℃，溫度過高會加速碘甲烷揮發(fā)，降低反應(yīng)收率，因此本實(shí)驗設(shè)定的4個反應(yīng)溫度分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。結(jié)果表明反應(yīng)溫度對收率影響較小，對反應(yīng)時間影響較大。在20 ℃時，反應(yīng)完全結(jié)束需要48 h，而35 ℃時僅需要5 h，可以大大提高效率(反應(yīng)規(guī)模為10 mmol，收率以甲醇-13C作為起始物計算)。

表2 反應(yīng)溫度的篩選Table 2 Screening of reaction temperature

2.4 Williamson反應(yīng)濃度的篩選

隨后本文進(jìn)行了反應(yīng)規(guī)模放大研究。當(dāng)反應(yīng)的量從10 mmol增加到100 mmol時，反應(yīng)時間從5 h增加到21 h，為了縮短反應(yīng)時間，本文嘗試增加反應(yīng)液的濃度，實(shí)驗表明反應(yīng)時間隨著濃度的增大而縮短?？紤]到反應(yīng)體系中含有大量的固體碳酸鉀，最終的反應(yīng)濃度定位1 mol/L。

表3 反應(yīng)液濃度的篩選Table 3 Screening of reaction solution concentration

2.5 中試工藝及結(jié)果

通過Williamson合成方案實(shí)驗條件的篩選，本文優(yōu)化好的條件為：碳酸鉀做堿；乙腈作反應(yīng)溶劑；反應(yīng)溫度為35 ℃；反應(yīng)液濃度為1 mol/L。隨后本文進(jìn)行了放大試驗研究，將反應(yīng)規(guī)模放大至1 mol。在產(chǎn)物的純化過程中，本文使用堿液攪拌分離掉沒有參與反應(yīng)的對乙酰氨基酚，之后在乙醇溶劑中重結(jié)晶即可得到美沙西汀結(jié)晶品。在放大反應(yīng)的操作中，每次實(shí)驗合成階段的時間約為20 h，后處理與純化操作的時間約為30 h。

表4 美沙西汀-甲氧基-13C的工藝放大路線及收率Table 4 Process route and yield of methacetin-methoxy-13C

3 結(jié) 論

通過對溶劑、溫度和濃度等關(guān)鍵實(shí)驗參數(shù)的研究，確定了最優(yōu)的合成工藝參數(shù)，解決了百克級合成美沙西汀-甲氧基-13C的難題。在百克級的合成中，以甲醇-13C為標(biāo)記原料的總收率在65%左右，產(chǎn)品美沙西汀-甲氧基-13C純度在99%左右。美沙西汀-甲氧基-13C的同位素豐度相對于標(biāo)記原料甲醇-13C未發(fā)生明顯降低。美沙西汀-甲氧基-13C的合成為進(jìn)一步的呼氣試驗研究提供了基礎(chǔ)。