王海燕

中國食品藥品檢定研究院/國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評價重點實驗室

王欣然

中國食品藥品檢定研究院/國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評價重點實驗室

路勇＊

中國食品藥品檢定研究院/國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評價重點實驗室

隨著消費者對化妝品的需求日益增長，化妝品的安全日漸被大眾重視。非法添加藥物及禁用組分是造成化妝品安全問題的重要因素。禁用組分是指不得作為化妝品原料使用的物質(zhì)。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）中列入的禁用組分共1393種，其中化妝品禁用原料1284 種，化妝品禁用植（動）物原料109 種。傳統(tǒng)檢測方法已無法滿足安全風(fēng)險物質(zhì)的檢測要求，為提高化妝品安全監(jiān)管效率，擴(kuò)大風(fēng)險物質(zhì)檢驗范圍，高通量快速篩查檢測技術(shù)應(yīng)運而生[1-6]，突破了現(xiàn)有檢測方式的局限性，加大了非法添加禁用組分的篩查維度。隨著化妝品安全隱患的不斷隱蔽化，出現(xiàn)了非法添加禁用組分外的風(fēng)險物質(zhì)現(xiàn)象，如添加禁用組分的衍生物，甚至出現(xiàn)添加經(jīng)修飾合成的風(fēng)險化合物以規(guī)避監(jiān)管的現(xiàn)象，因此，化妝品未知風(fēng)險物質(zhì)的篩查鑒定技術(shù)也急需建立完善，及時應(yīng)對瞬息萬變的安全隱患。

1 化妝品高通量靶向風(fēng)險物質(zhì)篩查檢測技術(shù)

針對化妝品中禁限用物質(zhì)、經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動非法添加、污染、衍生性效應(yīng)物質(zhì)等情況，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱：中檢院）建立了化妝品安全風(fēng)險物質(zhì)高通量篩查檢測技術(shù)，積極開展化妝品禁限用及其他風(fēng)險物質(zhì)高通量篩查集成方法的研究及應(yīng)用，綜合我國和國際標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)，以及新發(fā)現(xiàn)的污染物和衍生性效應(yīng)物質(zhì)等，優(yōu)化整合化妝品膏霜乳、液體、凝膠、粉劑、塊狀、泥、蠟基、噴霧劑、氣霧劑等各類基質(zhì)的前處理技術(shù)，建立了激素類物質(zhì)、抗感染類藥物、抗組胺類藥物、抗角質(zhì)化類藥物、解熱鎮(zhèn)痛類藥物、腎上腺素類藥物、麻醉類藥物、精神類藥物、防腐劑、著色劑、熒光增白劑、包裝遷移物、N-亞硝胺類化合物、有機(jī)溶劑殘留、農(nóng)藥殘留、前列腺素及其類似物、致敏性香料、全氟化合物等內(nèi)容全面的化妝品風(fēng)險物質(zhì)篩查庫。樣品進(jìn)樣后得到各化合物的母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、保留時間、同位素信息，將檢測樣品中各化合物的母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、保留時間、同位素信息與建立的風(fēng)險化合物數(shù)據(jù)庫中的信息進(jìn)行比對，對安全風(fēng)險物質(zhì)進(jìn)行高通量篩查。下面是實驗室已建立的部分風(fēng)險化合物數(shù)據(jù)信息。

1.1 實驗部分

1.1.1 儀器

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀（Waters 公司）；Xevo G2 XSQ-TOF 四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（Waters 公司）。

1.1.2 試劑

乙腈、甲酸銨、甲酸，均為質(zhì)譜純。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各個化合物標(biāo)準(zhǔn)品10mg（精確至0.0001g）至10ml 棕色量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制濃度為1.0mg/ml 的儲備液。

分別準(zhǔn)確移取各化合物的儲備液10μl 至10ml 量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制濃度為1μg/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1ml 至10ml 量瓶中，用水定容至刻度，配制濃度為100ng/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.4 樣品制備

1.1.4.1 膏霜乳液類、液態(tài)水基類、凝膠類、面膜類樣品

稱取樣品0.2g（精確到0.001g），置于10ml 具塞比色管中，加入少量乙腈，在渦旋混合儀上渦旋混勻，然后加入乙腈至近刻度，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，4000r/min 離心10min，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

1.1.4.2 液態(tài)油基類樣品

稱取樣品0.2g（精確至0.001g），置于離心管中，加入2ml 正己烷，在渦旋混合儀上分散，然后加入70%乙腈3ml，渦旋混勻，4000r/min離心10min，吸取下層溶液至10ml 比色管中，上層正己烷層用70%乙腈3ml，渦旋混勻，4000r/min離心10min，吸取下層溶液至10ml 比色管中，合并兩次溶液，加50%乙腈定容至刻度，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

1.1.4.3 塊狀類樣品

稱取樣品0.2g（精確到0.001g），置于10ml具塞比色管中，加入乙腈至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，乙腈定容至刻度，搖勻，4000r/min離心10min，濾過，用等體積乙腈溶液稀釋，稀釋液經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

稱取樣品0.2g（精確到0.001g），置于10ml具塞比色管中，加四氫呋喃1ml，渦旋使樣品分散，加乙腈混合溶液（含0.2%甲酸）至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈混合溶液（含0.2%甲酸）定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液0.5ml，加水0.5ml，渦旋混勻，4000r/min 離心10min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜濾過，濾液作為待測溶液。

1.1.4.5 粉類、泥類樣品

稱取樣品0.2g（精確到 0.001g），置于10ml具塞比色管中，加乙腈混合溶液（含0.2%甲酸）至近刻度，渦旋混勻，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈混合溶液（含0.2%甲酸）定容至刻度，4000r/min 離心10min，取上清液0.5ml，加水0.5ml，渦旋混勻，4000r/min 離心10min，取上清液，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

1.1.5 實驗條件

1.1.5.1 UPLC 分離條件

進(jìn)樣體積：3.0μl；色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流速：0.35ml/min；正離子模式流動相：A=2mmol/L 甲酸銨水溶液（含0.05%甲酸），B=乙腈；負(fù)離子模式流動相：A=2mmol/L甲酸銨水溶液，B=乙腈。UPLC 梯度洗脫程序見表1。

表1 UPLC 梯度洗脫程序

1.1.5.2 Q-TOF-MS 測定條件

電噴霧離子源條件：離子極性：ESI+/-；毛細(xì)管電壓：1kV；離子源溫度：120℃；采樣錐孔電壓：20V；脫溶劑溫度：550℃；錐孔氣流：50L/h；脫溶劑氣流：1000L/h；低碰撞能量：4eV；高碰撞能量：15～50eV；質(zhì)量掃描范圍：50～1200m/z；實時校正液：亮氨酸腦啡肽溶液（200pg/μl）。

1.2 結(jié)果與討論

化妝品風(fēng)險物質(zhì)篩查分析流程見圖1。建立的風(fēng)險物質(zhì)篩查數(shù)據(jù)庫中每一個化合物條目包含中文名、英文名、化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式、平均分子量、單同位素精確分子量、CAS 號等基本信息。此外，每個化合物還具有關(guān)鍵定性信息：保留時間及高分辨二級碎片。篩查庫中保留時間對應(yīng)推薦的色譜條件，二級碎片信息對應(yīng)推薦的碰撞能量。非數(shù)據(jù)依賴型采集模式，由“低碰撞能”和“高碰撞能”2種掃描交替構(gòu)成，有效進(jìn)行高低能量譜圖的匹配，降低假陽性。一針進(jìn)樣同時獲得一級二級高分辨質(zhì)譜信息，保留了數(shù)據(jù)的完整性，后續(xù)需要增加篩查目標(biāo)時，不需再次處理樣品和進(jìn)樣，重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可進(jìn)行分析。

11月16日，科技部組織專家對貴州省2015年承擔(dān)的“喀斯特山區(qū)中藥資源可持續(xù)利用關(guān)鍵技術(shù)”國家科技支撐計劃項目進(jìn)行驗收。

圖1 化妝品風(fēng)險物質(zhì)篩查分析流程

1.2.1 抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

抗感染類藥物與激素類化合物憑借其快速消炎止癢及使皮膚光滑細(xì)膩的假象，一直是實驗室化妝品非法添加物篩查的工作重點[7]?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法包含的化合物數(shù)量有限，無法涵蓋風(fēng)險物質(zhì)的種類。實驗室建立的方法通過色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行逐步擴(kuò)充，并以基質(zhì)加標(biāo)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)庫驗證。樣品進(jìn)樣后得到各化合物的母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、保留時間、同位素信息，將檢測樣品中各化合物的母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比、保留時間、同位素信息與數(shù)據(jù)庫中的信息進(jìn)行比對，通過平臺計算打分對含有的安全風(fēng)險物質(zhì)進(jìn)行定性篩查；將經(jīng)篩查確證為陽性的樣品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算安全風(fēng)險物質(zhì)的含量。部分抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)信息見表2。

表2 抗感染類藥物與激素類化合物數(shù)據(jù)信息

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

在激素類化合物中，有多組化合物互為同分異構(gòu)體，尤其是分離難度大的順反異構(gòu)體及差向異構(gòu)體。同分異構(gòu)體在本實驗條件下可得到良好的分離，圖2 為部分激素類化合物同分異構(gòu)體的分離效果。

圖2 激素類化合物同分異構(gòu)體的分離

1.2.2 致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)庫的建立

香精香料能夠賦予化妝品愉悅的氣味，掩蓋產(chǎn)品基質(zhì)的氣味，使化妝品散發(fā)出產(chǎn)品獨特的芬芳。然而隨著香精香料的不斷應(yīng)用與發(fā)展，呈現(xiàn)的安全問題也日漸被關(guān)注。香精香料引發(fā)的化妝品安全事件中，最具代表性的為化妝品過敏。因致敏性香精香料而引發(fā)的過敏案例占化妝品過敏案例的1/3 以上。歐盟規(guī)定了常見的26 種致敏性香精香料的使用限值。目前常見的檢測方法大多僅包含歐盟規(guī)定的26 種化合物，對于化妝品風(fēng)險致敏性香精香料的覆蓋是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。實驗室對致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行擴(kuò)充，部分致敏性香精香料化合物數(shù)據(jù)信息見表3。

其中，歐前胡素與異歐前胡素互為同分異構(gòu)體，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖3。

圖3 歐前胡素與異歐前胡素

4-甲氧基香豆素，6-羥基-4 甲基香豆素和4-羥基-7-甲基香豆素互為同分異構(gòu)體，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖4。

圖4 4-甲氧基香豆素，6-羥基-4 甲基香豆素和4-羥基-7-甲基香豆素

1.2.3 麻醉類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

化妝品中常見的非法添加麻醉類藥物多為普魯卡因等具有局麻效果的物質(zhì)，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）化妝品禁用組分列表羅列了普魯卡因等具有局麻效果的化合物，并建立了相應(yīng)的檢測方法?，F(xiàn)已報道的檢測方法也多為此類局麻物質(zhì)。然而除此類局麻物質(zhì)之外，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）化妝品禁用組分列表第956 條“麻醉藥類（凡是中國藥政法規(guī)定管制的麻醉藥品品種）”。此類化合物在日常檢測中常被忽視。實驗室對局麻類藥物之外的麻醉類化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了不斷地擴(kuò)充，部分麻醉類化合物數(shù)據(jù)信息見表4。

表4 麻醉類化合物數(shù)據(jù)信息

續(xù)表

其中，互為同分異構(gòu)體的氫嗎啡酮和去甲可待因，在本實驗條件下可得到良好的分離，見圖5。

圖5 氫嗎啡酮和去甲可待因

1.2.4 全氟化合物數(shù)據(jù)庫的建立

全氟化合物是一類具有疏水結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[8]，憑借此結(jié)構(gòu)使其理化性質(zhì)獨特，廣泛應(yīng)用于化妝品中。研究表示，長期接觸全氟化合物會加大患病風(fēng)險。我國生態(tài)環(huán)境部等11 個部委于2019 年聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于禁止生產(chǎn)、流通、使用和進(jìn)出口林丹等持久性有機(jī)污染物的公告》，規(guī)定“自2019 年3 月26日起，禁止全氟辛基磺酸及其鹽類和全氟辛基磺酰氟除可接受用途外的生產(chǎn)、流通、使用和進(jìn)出口”。實驗室隨即開展全氟辛基磺酸檢測方法的研究建立，并在此基礎(chǔ)上對全氟化合物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行擴(kuò)充，全氟化合物數(shù)據(jù)信息見表5。

表5 全氟化合物數(shù)據(jù)信息

續(xù)表

1.2.5 前列腺素類化合物數(shù)據(jù)庫的建立

比馬前列素作為治療青光眼專用藥物[9]，具有促進(jìn)睫毛生長的副作用，被不良企業(yè)添加到睫毛精華中，以求取得利潤，實驗室展開了前列腺素類化合物及其類似物檢測方法的制定，不斷擴(kuò)充至化妝品風(fēng)險物質(zhì)篩查數(shù)據(jù)庫，表6 為擴(kuò)展前列腺素類化合物數(shù)據(jù)信息。

表6 前列腺素類化合物數(shù)據(jù)信息

此外，對于歐盟新規(guī)定的化妝品中禁止添加的前列腺素類化合物也隨即開展篩查數(shù)據(jù)的建設(shè)，見表7。

表7 新規(guī)定的前列腺素類化合物數(shù)據(jù)信息

續(xù)表

1.2.6 實驗室日常監(jiān)測工作中篩查風(fēng)險化合物應(yīng)用舉例

實驗室在日常監(jiān)測工作中篩查出化合物應(yīng)用舉例見圖6。通過一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、二級譜圖碎片離子比對、保留時間、同位素豐度比等信息，與數(shù)據(jù)庫中的信息進(jìn)行比對，篩查樣品中含有的風(fēng)險化合物。

圖6 為應(yīng)用實例，通過對一級質(zhì)譜篩查出的可疑風(fēng)險物質(zhì)進(jìn)行一級同位素分布和母離子精確質(zhì)量數(shù)匹配分析，再對二級碎片豐度比和精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行匹配，主要碎片均與結(jié)構(gòu)完全匹配，碎片的精確質(zhì)量數(shù)偏差小于0.001Da，并結(jié)合匹配得分值判斷樣品中含有克霉唑。

圖6 實際應(yīng)用舉例

2 化妝品非靶向風(fēng)險物質(zhì)篩查鑒定技術(shù)

隨著化妝品非法添加向衍生修飾及合成的方向發(fā)展，化妝品非靶向風(fēng)險物質(zhì)的篩查鑒定技術(shù)急需出臺。中檢院在成功完成非法添加未知物的檢測鑒定任務(wù)中，初步建立了化妝品未知風(fēng)險物質(zhì)篩查鑒定流程。首先通過查找相關(guān)文獻(xiàn)和輿情報道，分析可能添加的可疑風(fēng)險物質(zhì)類型。接下來進(jìn)行可疑化合物掃描分析，采用限制條件對可疑化合物進(jìn)行篩選。分子式歸屬時需滿足分子元素組成、不飽和度、精確分子質(zhì)量誤差。通過限制條件減少潛在分子離子峰的數(shù)目。對二級質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，推測該化合物可能的分子結(jié)構(gòu)。通過在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的次級結(jié)構(gòu)檢索和分子式檢索獲得相關(guān)母體化合物信息。搜索母體化合物的功效和輿情信息進(jìn)一步驗證推測結(jié)構(gòu)的可能性。利用不同色譜分離系統(tǒng)，對樣品進(jìn)行初步純化、富集，采用中、高壓制備色譜進(jìn)行制備，得到單體化合物。通過高分辨質(zhì)譜對單體化合物進(jìn)行測定，得到其準(zhǔn)確分子式。利用一維和二維核磁共振波譜對單體化合物進(jìn)行測定，得到化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[10-13]。圖7 為實驗室在成功完成非靶向化合物非法添加案例中建立的檢驗方法流程。

圖7 化妝品非靶向風(fēng)險化合物篩查鑒定

3 結(jié)論

化妝品中可能存在的風(fēng)險物質(zhì)包括激素類化合物、抗感染類藥物等非法添加風(fēng)險物質(zhì)及外源性風(fēng)險物質(zhì)。目前，為了逃避監(jiān)管，已出現(xiàn)添加風(fēng)險物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物及衍生物現(xiàn)象。為了全面篩查風(fēng)險物質(zhì)，保障消費者用妝安全，中檢院建立了化妝品風(fēng)險物質(zhì)篩查平臺，在風(fēng)險監(jiān)測實際工作應(yīng)用中，平臺對激素類化合物、抗感染類藥物、抗組胺類藥物、致敏性香精香料、前列腺素類化合物等非法添加都進(jìn)行了有效的篩查分析，起到了靶向風(fēng)險物質(zhì)的廣泛篩查效果。針對非靶向風(fēng)險物質(zhì)，中檢院也初步建立了相應(yīng)的篩查鑒定流程，并且在兒童化妝品非法添加本維莫德事件中，得到了良好應(yīng)用。中檢院在健全完善靶向風(fēng)險物質(zhì)篩查數(shù)據(jù)庫的同時，不斷提升非靶向風(fēng)險物質(zhì)篩查技術(shù)，為保障化妝品安全提供了技術(shù)支撐。