喬亞森

中國(guó)食品藥品檢定研究院

林思靜

中國(guó)食品藥品檢定研究院

董亞蕾＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院

黃傳峰

中國(guó)食品藥品檢定研究院

趙萌

中國(guó)食品藥品檢定研究院

王海燕＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院

1 引言

食品、化妝品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，十分有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，因此，在食品和化妝品中加入一定量的防腐劑能夠預(yù)防和延緩產(chǎn)品內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，防止產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。苯甲醇具有中等抗菌活性[1-2]，可以抑制革蘭陽(yáng)性菌、霉菌、真菌和酵母菌[3]，且價(jià)格較低，因此不但被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，還是制藥[4-6]和化妝品行業(yè)中最常使用的防腐劑之一。GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中將苯甲醇列為允許使用的食品用合成香料。GB 1886.135-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 苯甲醇》中規(guī)定了食品添加劑苯甲醇的相關(guān)指標(biāo)?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》[7]規(guī)定，苯甲醇作為防腐劑在化妝品中使用時(shí)，其最大允許濃度不得超過1.0%。然而，有些不法商家為了達(dá)到足夠的防腐效果，存在在化妝品中加入過量的苯甲醇的情況，過量使用將對(duì)消費(fèi)者的眼、上呼吸道、皮膚產(chǎn)生刺激作用。因此，化妝品中苯甲醇的檢測(cè)，不僅是化妝品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制的重要工作，也是化妝品檢驗(yàn)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

能力驗(yàn)證是一種通過實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的校準(zhǔn)或檢測(cè)能力的活動(dòng)。能力驗(yàn)證的結(jié)果可作為管理部門、評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)等判定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的參考依據(jù)，同時(shí)可作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的有效補(bǔ)充[8-10]，還能達(dá)到幫助其提高項(xiàng)目檢驗(yàn)水平的目的。

苯甲醇的測(cè)定是食品、化妝品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室日常監(jiān)管中的重要技術(shù)監(jiān)測(cè)內(nèi)容，通過對(duì)化妝品中苯甲醇含量測(cè)定的能力驗(yàn)證結(jié)果的研究與分析，能夠客觀了解我國(guó)化妝品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的能力水平[11]。作為中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）認(rèn)可的能力驗(yàn)證提供者，中國(guó)食品藥品檢定研究院組織并實(shí)施了本次能力驗(yàn)證工作。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

島津GC-2030 氣相色譜儀（島津公司）；HP-FFAP 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm， 安捷倫公司）；Waters 2695 高效液相色譜儀（Waters 公司）；資生堂CAPCELL PAC C18 4.6 mm×250 mm 5μm 色譜柱（資生堂公司）。

苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%,中國(guó)食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（質(zhì)譜純，F(xiàn)isher 公司）。

2.2 能力驗(yàn)證樣品

樣品委托有關(guān)公司生產(chǎn)。樣品形態(tài)為乳液，經(jīng)完全溶解、總混、分裝、封口等步驟制備。樣品中苯甲醇含量約4 mg/kg。樣品用10 ml 棕色塑料瓶包裝，鋁箔熱封內(nèi)蓋，每瓶5 g，密封，標(biāo)記，寄送前冷藏保存。

2.3 檢測(cè)方法

推薦使用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》中防腐劑檢驗(yàn)方法 4.1 苯甲醇 第一法氣相色譜法或第二法高效液相色譜法，也可采用實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)方法。

2.4 均勻性考察

根 據(jù)CNAS-GL003:2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[12]的要求，在最小包裝樣品中隨機(jī)抽取樣品10 瓶，每瓶樣品平行取2 份，采用氣相色譜法測(cè)定其中苯甲醇的含量，采用單因子方差分析法對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以考察樣品的均勻性。

2.5 穩(wěn)定性考察

樣品發(fā)送前，從最小包裝樣品中隨機(jī)抽取3 份樣品，每份樣品平行取2 份，采用氣相色譜法測(cè)定其中苯甲醇的含量。再隨機(jī)抽取3 份樣品，于冷庫(kù)儲(chǔ)存一個(gè)月，模擬樣品發(fā)樣過程中的郵寄路線及存儲(chǔ)環(huán)境后，對(duì)樣品進(jìn)行回收，并采用同樣的方法進(jìn)行測(cè)定。2 次測(cè)定時(shí)間相差一個(gè)月，分別代表樣品發(fā)送前和發(fā)送后的狀態(tài)。將穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果與均勻性結(jié)果比較，采用t檢驗(yàn)法對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.6 樣品發(fā)放

本次能力驗(yàn)證樣品外包裝標(biāo)識(shí)為NIFDC-PT-N-XX，其中N 代表本次能力驗(yàn)證代碼， XX 表示實(shí)驗(yàn)室代碼。依據(jù)隨機(jī)原則向每個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放樣品1 瓶。

2.7 結(jié)果評(píng)價(jià)原則

根 據(jù)CNAS-GL002:2018《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[13]并參考文獻(xiàn)[14]對(duì)能力驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用所有參加者結(jié)果的中位值（M）作為指定值，標(biāo)準(zhǔn)化四分位距（NIQR）作為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算苯甲醇測(cè)定結(jié)果的z比分?jǐn)?shù)。

z比分?jǐn)?shù)的大小反映了實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與中位值的偏離程度，z比分?jǐn)?shù)的符號(hào)“+”和“-”代表與M的偏離方向，“+”表示結(jié)果大于M，“-”表示結(jié)果小于M。∣z∣≤2 為結(jié)果滿意；2 ＜∣z∣＜ 3 為結(jié)果可疑，鼓勵(lì)實(shí)驗(yàn)室復(fù)查結(jié)果，找出原因；∣z∣≥ 3 為結(jié)果不滿意（離群值）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃采用穩(wěn)?。╮obust）統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)各參加實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果。本研究涉及的統(tǒng)計(jì)量包括結(jié)果數(shù)、M、NIQR、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）、最小值、最大值和極差等。

3 結(jié)果與分析

3.1 能力驗(yàn)證樣品的均勻性和穩(wěn)定性考察結(jié)果

3.1.1 均勻性分析

樣品的均勻性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在95%置信度下，自由度為9 時(shí)，計(jì)算值F（F=2.43）小于查表值Fcrit（Fcrit=3.02），說明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品中苯甲醇含量測(cè)定結(jié)果的均勻性良好，確保了參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的可評(píng)價(jià)性。

3.1.2 穩(wěn)定性分析

將穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果與均勻性檢驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果對(duì)比，進(jìn)行t檢驗(yàn)。t值均小于95%置信區(qū)間查表值，表明在本研究實(shí)施期間測(cè)試樣品中的苯甲醇是穩(wěn)定的。

3.2 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

分別采用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》中防腐劑檢驗(yàn)方法 4.1 苯甲醇 第一法氣相色譜法和第二法高效液相色譜法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以氣相色譜法測(cè)定結(jié)果為變量1，以高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為變量2，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，t值為1.19，小于95% 置信區(qū)間查表值（2.36）。說明兩種方法一致性良好，不同實(shí)驗(yàn)室采用兩種方法檢測(cè)結(jié)果能夠用于統(tǒng)計(jì)分析。

3.3 能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本次能力驗(yàn)證共有26 個(gè)實(shí)驗(yàn)室反饋了結(jié)果。采用JMP 軟件統(tǒng)計(jì)測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)的頻率，根據(jù)測(cè)定結(jié)果及頻率得到測(cè)定結(jié)果分布直方圖（圖1）。由圖1 可知，測(cè)定數(shù)據(jù)呈現(xiàn)明顯的單峰分布，M結(jié)果最為集中。在95%置信度下，結(jié)果數(shù)據(jù)基本服從正態(tài)分布，可以用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖1 苯甲醇結(jié)果正態(tài)分布直方圖

通過系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室反饋的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果詳見表1。本次能力驗(yàn)證，23 家實(shí)驗(yàn)室∣z∣≤ 2，檢測(cè)結(jié)果為滿意，3 家實(shí)驗(yàn)室2 ＜∣z∣＜ 3，檢測(cè)結(jié)果為可疑，滿意率為88.5%。

表1 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量匯總表

應(yīng)用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)分析方法，計(jì)算各反饋結(jié)果實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室z比分?jǐn)?shù)，表2 詳細(xì)列出26 家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果和各評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)量。

表2 26 家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)表

3.4 結(jié)果分析

3.4.1 總體概況

26 家參加實(shí)驗(yàn)室分布于15個(gè)省（自治區(qū)、直轄市），其中食品藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)共有22 家，占參加者總數(shù)的84.6%，包括省級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)5 家、地市級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)17家，地市級(jí)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)占多數(shù)；參加實(shí)驗(yàn)室中還包括第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)4 家，占比15.4%。按實(shí)驗(yàn)室層級(jí)分類，分別統(tǒng)計(jì)結(jié)果滿意率，省級(jí)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果滿意率為100%，地市級(jí)次之，第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)滿意率為75%。但由于樣本量較少，該結(jié)果不能完全反映第三方實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，詳見表3。

表3 參加實(shí)驗(yàn)室信息統(tǒng)計(jì)

3.4.2 檢測(cè)方法

本次能力驗(yàn)證推薦方法為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》中防腐劑檢驗(yàn)方法的4.1 苯甲醇，該章節(jié)中包含兩種方法，第一法為氣相色譜法，第二法為高效液相色譜法。從各實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果看，23 家實(shí)驗(yàn)室使用了推薦的氣相色譜法，3 家實(shí)驗(yàn)室采用了高效液相色譜法。使用的氣相色譜儀品牌，18 家為安捷倫、3 家為島津、賽默飛世爾和PE 各一家。使用的色譜柱涉及品牌較多。使用不同色譜柱和儀器未造成測(cè)定結(jié)果的偏離。

3.4.3 對(duì)照品

從使用的對(duì)照品情況看，12家單位采用中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的對(duì)照品，11 家單位采用德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司的對(duì)照品，另有阿拉丁、Bepure、L/TMS 等品牌的對(duì)照品各1 家，除一家純度為99.1%外，其余純度均大于99.8%。

3.4.4 前處理方法

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》4.1 苯甲醇第一法氣相色譜法中，規(guī)定的前處理方法為稱取樣品0.5～1.0 g，加入無水乙醇渦旋振蕩并于50 ℃水浴中加熱5 min，超聲提取20 min，最終用無水乙醇稀釋至刻度。第二法高效液相色譜法中則采用甲醇為提取溶劑，其他操作與第一法中相同。提取是該實(shí)驗(yàn)中的操作關(guān)鍵步驟，提取不完全會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏低。

從提取溶劑看，采用氣相色譜法的實(shí)驗(yàn)室全部采用無水乙醇作為提取溶劑，但其中一家測(cè)定結(jié)果偏高，一家測(cè)定結(jié)果偏低。采用高效液相色譜法的全部采用甲醇作為提取溶劑，其中一家結(jié)果偏低，造成其評(píng)價(jià)結(jié)果可疑。從結(jié)果分析，提取溶劑或者采用色譜方法不同并不是造成結(jié)果可疑的主要因素，還可能存在其他能夠?qū)е陆Y(jié)果出現(xiàn)偏差的因素。

3.4.5 發(fā)現(xiàn)的具體問題

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》4.1 苯甲醇 第一法氣相色譜法的規(guī)定，當(dāng)樣品中含量為0.05%～0.5%范圍內(nèi)時(shí)，測(cè)定結(jié)果的平均回收率應(yīng)在97.9%～108.7% 范圍內(nèi)。本研究中苯甲醇的含量水平為0.4%，因此，各實(shí)驗(yàn)室的加標(biāo)回收率應(yīng)能達(dá)到以上要求。但是，兩家結(jié)果為可疑的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果表明，回收率分別為95.2%和95.4%。相比之下，回收率偏低，不能達(dá)到正?；厥章史秶?。樣品稱樣量較大，不利于樣品的充分提取，這可能是導(dǎo)致回收率偏低的潛在原因。

另外一家實(shí)驗(yàn)室所用的色譜柱類型和儀器品牌與其他實(shí)驗(yàn)室相同，但保留時(shí)間與其他實(shí)驗(yàn)室相比延遲幅度較大，造成最終結(jié)果偏高。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)色譜柱狀態(tài)的監(jiān)控，以及核查和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作過程，是控制偶然誤差產(chǎn)生的重要方法。

4 結(jié)論

本次能力驗(yàn)證的結(jié)果在一定程度上反映了我國(guó)相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)化妝品中苯甲醇的檢測(cè)能力，參加實(shí)驗(yàn)室中88.5%的測(cè)定結(jié)果為滿意，檢測(cè)水平較高，為我國(guó)化妝品中防腐劑的檢測(cè)與監(jiān)督執(zhí)法提供了強(qiáng)有力的支持。通過能力驗(yàn)證考核，亦能夠幫助實(shí)驗(yàn)室尋找原因，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制，最終達(dá)到提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的目的。