苗麗娟 武梅 孫禮 王劍 毛寶宏 武美麗 姚婷婷 王曉霞 劉青

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

宮頸癌是最常見的婦科癌癥之一，近年來，發(fā)病率和死亡率逐年上升，引起全球關注［1-2］。宮頸癌發(fā)病的因素較多，近年來一些研究表明，低氧微環(huán)境對癌癥的發(fā)生發(fā)展有重要影響，低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor、HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為已被證明在癌癥發(fā)生歷程中有直接影響的重要轉錄因子，在宮頸癌形成階段的作用是一個值得被研究的領域［3-5］。本研究通過三氣培養(yǎng)箱模擬缺氧條件下對人宮頸癌Hela 細胞進行體外培養(yǎng)，探究低氧條件下HIF-1α 和VEGF 在宮頸癌細胞中的轉錄變化規(guī)律，探討宮頸癌治療和改善預后的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人宮頸癌Hela 細胞（甘肅省動物細胞創(chuàng)新中心）；HIF-1α 多克隆抗體；VEGF 多克隆抗體；Cy3-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（北京博奧森生物技術有限公司）；DMEM 高糖細胞培養(yǎng)液（蘭州百靈生物技術有限公司）；新生牛血清NBS；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）；Normal Goat Serum（原液）（蘭州民海生物工程有限公司）；4%多聚甲醛；DAPI solution（ready-to-use）（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 復蘇人宮頸癌Hela 細胞，在37℃、5%CO2、飽和濕度的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞單層融合率約為80%且形態(tài)正常、長勢良好時傳代，分為低氧培養(yǎng)組與常氧培養(yǎng)組兩組。

1.3 細胞低氧及常氧培養(yǎng)環(huán)境的建立 常氧：普通培養(yǎng)箱設置條件為37℃，CO2濃度5%、O2濃度21%。低氧：低氧培養(yǎng)箱設置條件為37℃，CO2濃度5%、O2濃度5%。

1.4 細胞爬片 常氧和低氧兩組細胞分別通過胰蛋白酶消化法消化、離心，制成細胞懸液，均勻鋪于6 孔板中爬片，并分別在相應條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h，待細胞單層融合率約80%～90%時用4%多聚甲醛固定。

1.5 免疫熒光染色 固定完成的細胞爬片用PBS 溶液清洗后加入0.5%Triton X100 通透液，室溫通透15～20min；待細胞膜通透完成后再次用PBS 浸洗3 次并吸干多余液體，加入提前用原液稀釋的Normal GoatSerum，在室溫條件下封閉30min；30min 后用濾紙吸去封閉液，分別加入稀釋好的一抗HIF-1α 和VEGF（稀釋比例1 ∶300），在4℃冰箱中孵育12h。一抗孵育完成后洗脫雜質，滴入適量熒光二抗，37℃孵育2h 后在避光環(huán)境下用DAPI 染液將細胞核復染，洗脫雜質后封片以備觀察。利用熒光顯微成像系統(tǒng)采集實驗結果圖片，控制曝光時間和激發(fā)光電壓等參數(shù)條件相同。

1.6 數(shù)據分析 使用數(shù)據分析軟件Image pro plus6.0對熒光強度進行測量，Graphpad Prism 8 對實驗結果進行統(tǒng)計學分析，每組結果選取5 個隨機視野進行測量。t 檢驗進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF 的表達情況 細胞核與細胞漿中均存在VEGF 陽性表達。見圖1。使用圖片處理軟件對比分析發(fā)現(xiàn)：低氧培養(yǎng)條件下VEGF 在Hela 細胞中所展現(xiàn)的熒光強度值高于常氧培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖2、表1。

表1 VEGF 熒光強度檢測結果

圖1 VEGF 熒光染色結果

圖2 VEGF 熒光強度檢測結果

2.2 HIF-1α 的表達情況 細胞核中存在HIF-1α 大量陽性表達。見圖3。使用圖片處理軟件對比分析發(fā)現(xiàn)：低氧培養(yǎng)條件下HIF-1α 在Hela 細胞中所展現(xiàn)的熒光強度值高于常氧培養(yǎng)組，低氧培養(yǎng)組的細胞中HIF-1α 熒光強度與常氧培養(yǎng)組中相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖4、表2。

表2 HIF-1α 熒光強度檢測結果

圖3 HIF-1α 熒光染色結果

圖4 HIF-1α 熒光強度檢測結果

3 討論

宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，在國際癌癥研究機構提供的全球2018 癌癥發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計中，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均排在第四位［6］。造成宮頸癌患者死亡的大多數(shù)原因是腫瘤的侵襲和轉移。目前已經有大量研究證實HIF-1α 及VEGF 在宮頸癌Hela 細胞中高表達，研究［7］表明，在腫瘤細胞中HIF-1α 和VEGF 的高表達預示著更高的侵襲性和增殖性。

缺氧通常貫穿癌癥病程的始終，誘導細胞代謝過程中適應性改變，包括從氧化磷酸化到糖酵解的轉變，增加糖原合成，以及從葡萄糖到谷氨酰胺的開關作為脂肪酸合成的主要基材。這類廣泛的代謝變化由HIF-1α的表達水平協(xié)調以平衡供氧和需求［8］。HIF-1α 是腫瘤細胞適應缺氧而產生的一種核轉錄因子。在缺氧微環(huán)境下能夠激活其轉錄活性，使腫瘤的一些生物學特性改變，這些生物學特性包括腫瘤的侵襲、轉移以及腫瘤血管的形成等［9］。HIF-1α 也伴隨腫瘤的抑制劑（如VHL）功能和致癌因子增益損失，導致（PI3K / AKT /MTOR）活性在癌細胞內被激活，并介導癌癥發(fā)展和抗治療的代謝改變［4］。大量研究證實，VEGF 在多種人類腫瘤中均過度表達，是腫瘤血管生成的主要調控者。阻斷HIF-1α 從而減少VEGF 的轉錄及表達，可以抑制腫瘤的生長。研究表明HIF-1α/VEGF-A 軸是癌癥免疫的必需組成部分［10］。滲透腫瘤的毒性T 細胞在腫瘤內缺氧的微環(huán)境適應過程中調動HIF-1α。HIF-1α對于CD8+T 細胞的效應狀態(tài)至關重要。CD8+T 細胞中HIF-1α 的喪失可以降低腫瘤的浸潤能力和細胞殺傷，并減弱腫瘤的血管化。若CD8+T 細胞內缺失VEGFA，HIF 靶基因則促使腫瘤發(fā)生過程加速并同時促進血管化改變。有研究顯示VEGF-A 表達和CD8+T 細胞侵襲能力之間的關系呈反比。

低氧狀態(tài)能促使HIF-1α 和VEGF 在Hela 細胞中蛋白水平增高。本研究通過細胞免疫熒光染色Hela細胞，證實HIF-1α 及VEGF 在缺氧及常氧條件下的蛋白表達存在差異，在缺氧條件下，HIF-1α 及VEGF 均高表達，并且主要分布于細胞核中。提示HIF-1α 可能通過某種細胞信號通路影響VEGF 表達。有研究認為，HIF-1α 通過細胞內信號傳導途徑調節(jié)VEGF 表達，主要包括兩方面調節(jié)作用：一是介導了VEGF mRNA 的穩(wěn)定性增加；二是介導了VEGF 的轉錄活性增強［11］。也有學者推測，在腫瘤缺氧微環(huán)境中，表達增高的HIF-1α 經VEGF 基因轉錄起始點上游區(qū)域存在的缺氧反應元件誘導了下游VEGF 的高表達［12］。結合上述研究結論可推斷出低氧狀態(tài)在宮頸癌Hela 細胞的生長過程中具有重要作用，很可能通過影響HIF-1α 和VEGF 分子的表達從而介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在宮頸癌Hela 細胞中，HIF-1α 和VEGF 的表達依賴氧濃度的調節(jié)，改善宮頸癌組織中缺氧微環(huán)境，可能有助于改善宮頸癌患者HIF-1α 和VEGF 的水平，從而改善患者治療結局及遠期預后。因此，低氧環(huán)境對癌癥調控因子，如HIF-1α，VEGF 的影響可能為宮頸癌治療提供新的理論基礎和新的思路。