劉雅慧，陳蘭英，周朦靜，尹 力，羅穎穎，崔亞茹

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種以肺水腫和急性炎癥為特征的綜合征，是重癥患者發(fā)病和死亡的重要原因之一，臨床表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫[1]。最新研究表明，在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要生物活性成分，在急性肺損傷動物模型中，機體受到LPS刺激后出現(xiàn)肺水腫和炎性細胞浸潤，炎性細胞浸潤進一步導(dǎo)致活性氧和炎癥因子的釋放，最終出現(xiàn)急性肺損傷病變[2]。

澤漆是大戟科植物澤漆EuphorbiahelioscopiaL.的干燥全草，其性微寒、味苦，歸肺、小腸、大腸經(jīng)，具有利水消腫、消痰退熱、散結(jié)殺蟲等功效，為民間常用中草藥，被廣泛用于治療慢性阻塞性肺疾病等[3-4]?，F(xiàn)代研究表明澤漆的活性成分主要為二萜、黃酮、多酚等，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、清除自由基等藥理作用[5]。本實驗旨在研究澤漆在體內(nèi)外對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及調(diào)控蛋白JNK、p38、ERK1/2的干預(yù)效應(yīng)，進一步探討澤漆防治急性肺損傷的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，共40只；SPF級雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g，共50只，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2016-0002。本研究所涉及的動物實驗均經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心動物實驗倫理委員會審查批準，批準號為JZLLSC2018-0131。

1.2 細胞 RAW264.7細胞，購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.3 試劑與藥物 實驗用澤漆藥材購自北京仟草中藥飲片有限公司，由江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定為正品。醋酸地塞米松片(批號170203)購自浙江仙琚制藥股份有限公司；脂多糖(貨號L2880)購自美國Sigma公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號517-28-2)購自北京索萊寶科技有限公司；p-ERK1/2抗體(批號GR3192740-17)、p-p38抗體(批號GR223651-16)、p38 抗體(批號GR305364-10)、ERK1/2抗體(批號GR2971047-12)、JNK抗體(批號GR32333-11)、p-JNK抗體(批號GR3187606-5)均購自英國Abcam公司；β-tubulin抗體(批號01270/30251)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔(批號01334/40243)、羊抗鼠二抗(批號01325/50237)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號10245)均購自北京康為世紀生物科技有限公司；小鼠細胞因子檢測試劑盒(批號741043、740136)購自美國 Biolegend 公司。

1.4 儀器 RWD510型小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(德國 Leica公司)；Gallios型流式細胞儀(美國Beckman公司)；Spectra Max i3型酶標儀(德國Molecular Devices公司)；Chemi Doc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 澤漆水提物制備 取澤漆干燥全草，按1∶8的料液比，加水置于圓底燒瓶中，加熱提取2次，每次連續(xù)回流2 h，用紗布過濾合并濾液，減壓回收溶劑濃縮得稠浸膏，在真空條件下低溫干燥，即得澤漆水提物。

2.2 含藥血清制備 40只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機分成空白血清組、地塞米松含藥血清組(1.0 mg/kg)、澤漆水提物高劑量含藥血清組(5 g/kg)和澤漆水提物低劑量含藥血清組(2.5 g/kg)，每組10只[6]。每天灌胃給藥2次，灌胃劑量為10 mL/kg,灌胃給藥每次間隔12 h,連續(xù)灌胃給藥3 d，其中空白血清組灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥前8 h，禁食不禁水。末次給藥1 h后，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，待血清析出后，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，56 ℃水浴滅菌30 min，采用0.22 μm微孔濾膜過濾，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4 CCK-8法檢測含藥血清毒性 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，細胞密度調(diào)整為2×104/mL，每孔100 μL接種在96孔板中，待細胞貼壁生長后，開始分組給藥，共5組，分別為正常對照組、空白血清組、地塞米松含藥血清組、澤漆水提物高劑量含藥血清組和澤漆水提物低劑量含藥血清組，其中正常對照組更換成新鮮的DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別更換成含10%對應(yīng)血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，向每孔添加10 μL CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～4 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度，并計算細胞存活率。

2.5 RT-PCR法檢測細胞內(nèi)iNOS、TNF-ɑ、IL-6、IL-1βmRNA表達 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，細胞密度調(diào)整為2×105/mL，待細胞貼壁生長后，分組預(yù)給藥，其中空白血清組、模型組都更換成含10%空白血清的DMEM培養(yǎng)基，地塞米松含藥血清組、澤漆水提物高劑量含藥血清組、澤漆水提物低劑量含藥血清組則分別更換成含10%對應(yīng)含藥血清的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，預(yù)給藥1 h后，模型組以及各含藥血清組都添加LPS(1 μg/mL)刺激細胞，共孵育18 h[7]。收集各組RAW264.7細胞，用Trizol試劑提取總RNA,檢測RNA濃度后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本實驗所涉及的引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。將cDNA作為模板進行RT-PCR反應(yīng),根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書，配置反應(yīng)體系,其反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)，用2-△△CT法計算iNOS、TNF-ɑ、IL-6、IL-1βmRNA相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 動物模型復(fù)制及給藥 50只BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、地塞米松組(1.5 mg/kg)、澤漆水提物高劑量組(7.5 g/kg)和澤漆水提物低劑量組(3.75 g/kg)，每組10只。給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物(灌胃體積10 mL/kg)，每天1次，連續(xù)灌胃給藥3 d；其中正常組與模型組灌胃等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)[8]。末次給藥1 h后，用移液槍吸取含LPS(1 mg/kg)的PBS溶液，滴入模型組與各給藥組小鼠鼻腔內(nèi)，每只50 μL，復(fù)制急性肺損傷模型；正常組則給予等量生理鹽水。鼻腔滴入LPS 12 h后，處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織用于后續(xù)各項指標的檢測[8]。

2.7 流式細胞術(shù)檢測BALF中炎癥因子水平 取冷凍保存的BALF，采用小鼠細胞因子檢測試劑盒，按照說明書使用流式細胞儀檢測BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2.8 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化 取右肺組織，置于10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)變化。參照文獻[8]報道方法，根據(jù)肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁炎性細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚或透明膜形成進行檢查，分別進行0～4分半定量分析。0分為無病變或非常輕微；1分為輕度病病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。

2.9 Western blot法檢測小鼠肺組織中JNK、p38、ERK1/2蛋白表達 取冷凍保存的小鼠肺組織，添加RIPA裂解液充分研磨以提取蛋白，采用BCA法檢測各組蛋白濃度，并調(diào)適至相同蛋白濃度，沸水浴加熱5 min，使其變性。參照文獻[9]方法操作，最后用Image J軟件統(tǒng)計分析蛋白條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清的毒性實驗結(jié)果 使用空白血清及各含藥血清干預(yù)RAW264.7細胞24 h后，采用CCK-8法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)各組細胞存活率無明顯變化(P>0.05)，見圖1。說明空白血清及各含藥血清對RAW264.7細胞均沒有毒性作用。

3.2 澤漆水提物含藥血清對RAW264.7細胞內(nèi)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達的影響 與空白血清組比較，模型組RAW264.7細胞內(nèi)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)，表明已成功構(gòu)建RAW264.7細胞炎癥模型；與模型組比較，地塞米松含藥血清組和澤漆水提物高劑量含藥血清組RAW264.7細胞內(nèi)iNOS、TNF-α、IL-1βmRNA表達均降低(P<0.05，P<0.01)，IL-6 mRNA表達也有一定的降低趨勢；與模型組比較，澤漆水提物低劑量含藥血清組RAW264.7細胞內(nèi)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表達均有一定的降低趨勢，見圖2。上述結(jié)果表明，澤漆水提物含藥血清能干預(yù)LPS刺激RAW264.7細胞引起胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的異常表達。

圖1 各組細胞存活率Fig.1 Survival rate of cells in each

注：與空白血清組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組細胞內(nèi)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達Fig.2 mRNA expressions of iNOS,TNF-ɑ,IL-6 and IL-1β of cells in each

3.3 澤漆水提物對LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，澤漆水提物高劑量組和地塞米松組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，澤漆水提物低劑量組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平也有下降趨勢，見表2。

3.4 澤漆水提物對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肺泡大小正常未見充血，肺組織未見出血，肺泡腔和血管壁無明顯的炎性細胞或紅細胞浸潤或聚集，未見肺泡壁增厚；與正常組比較，模型組小鼠部分肺泡斷裂且未見完整肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡變小，肺泡壁增厚，肺泡腔或血管壁有大量炎性細胞和紅細胞聚集；與模型組比較澤漆水提物高劑量組與地塞米松組均得到明顯改善，澤漆水提物低劑量組也有一定的改善作用，見圖3。小鼠ALI病理評分結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠ALI病理評分升高(P<0.01)；與模型組比較，澤漆水提物高劑量組與地塞米松組ALI病理評分降低(P<0.05，P<0.01)，澤漆水提物低劑量組ALI病理評分亦有一定的降低趨勢，圖4。

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平Tab.2 Levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in BALF of mice in each

圖3 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE，×100)Fig.3 Pulmonary pathological changes of mice in each group(HE，×100)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 各組小鼠肺組織病理評分Fig.4 Pulmonary pathological scores of mice in each

3.5 澤漆水提物對LPS誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中JNK、p38、ERK1/2蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織中p-JNK、p-ERK1/2、p-p38蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組與澤漆水提高劑量組小鼠肺組織中p-JNK、p-ERK1/2、p-p38蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，澤漆水提低劑量組亦有一定的降低趨勢，見圖5。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 各組小鼠肺組織中JNK、p38、ERK1/2的蛋白表達Fig.5 Protein expressions of pulmonary JNK，p38 and ERK1/2 of mice in each

4 討論

急性肺損傷是臨床上常見的重癥呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率與死亡率都較高[10]，其特征是呼吸困難，間質(zhì)性水腫，活化的炎癥細胞積聚，中性粒細胞大量遷移以及彌漫性肺泡損傷[11]。澤漆具有利水消腫、消痰退熱等功效，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，澤漆對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有保護作用，但目前澤漆對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)揮保護作用的機制尚未完全明確。因此，本實驗從干預(yù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β及調(diào)控蛋白JNK、ERK、p38異常表達的角度出發(fā)，探討澤漆對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)揮保護作用的可能作用機制。

在急性肺損傷期間，肺炎癥因子主要是由肺泡巨噬細胞分泌，LPS可激活肺泡巨噬細胞，釋放大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子，從而導(dǎo)致機體細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，使肺部免疫反應(yīng)過度亢進，最終導(dǎo)致急性肺損傷病變[12-13]。TNF-α、IL-1β和IL-6是急性肺損傷的重要生物標志物[14]。其中TNF-α是腫瘤壞死因子家族重要成員，是最早參與急性肺損傷的炎癥因子，主要由單核巨噬細胞分泌，并通過模擬巨噬細胞誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等炎癥因子大量分泌。此外，TNF-α還能影響肺水腫的形成，加重肺損傷[15]。IL-6在炎癥的急性期反應(yīng)中起著重要的作用，它可以擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進炎癥爆發(fā)，從而加速急性肺損傷病變。IL-1β在急性肺損傷的進展中發(fā)揮著重要作用，它能增加跨肺泡-毛細血管屏障的蛋白滲透性，促進肺泡上皮修復(fù)，并能模擬其他炎癥因子的產(chǎn)生[16]。本實驗中，由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎癥模型胞內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達升高；與模型組比較，澤漆水提物高劑量含藥血清和地塞米松含藥血清能降低TNF-α、IL-1β的mRNA表達。澤漆水提物含藥血清與地塞米松含藥血清對LPS刺激RAW264.7細胞引起的胞內(nèi)IL-6 mRNA高表達也有一定降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，可能與含藥血清干預(yù)細胞的時間點有關(guān)。此外，iNOS被認為是炎癥發(fā)展過程中的細胞內(nèi)信使，在炎癥反應(yīng)過程中，巨噬細胞可通過iNOS的催化作用產(chǎn)生大量的NO，而過量的NO可能會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而加劇組織損傷，加速急性肺損傷病變[12]。本實驗中，澤漆水提物含藥血清與地塞米松含藥血清均能降低LPS刺激RAW264.7細胞引起的胞內(nèi)iNOSmRNA高表達。基于上述結(jié)果，初步推斷澤漆水提物對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的異常高表達有干預(yù)作用。

為進一步探討澤漆水提物對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響及其潛在機制，本實驗在動物水平上展開驗證。有研究報道，急性肺損傷患者中，BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度均升高，并且與不良預(yù)后有關(guān)[17]。本實驗中，模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，與文獻結(jié)果相一致；而澤漆水提物組和地塞米松組小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，與之前的體外實驗結(jié)果基本一致。這表明，澤漆水提物能改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的異常表達，減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。

JNK蛋白在各種組織中廣泛表達，調(diào)控細胞對外來刺激所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。當受到LPS刺激后，JNK磷酸化并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，調(diào)控AP-1的活性，使其下游細胞細胞因子TNF-α、iNOS等表達異常[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷病變過程中，JNK活化還增加了急性肺損傷小鼠血清中IL-6的表達，加重急性肺損傷模型小鼠肺水腫[20]。p38作為MAPK家族中調(diào)控炎癥反應(yīng)的最主要成員，在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在急性肺損傷病變過程中，p38磷酸化，導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子異常高表達，增加肺內(nèi)皮細胞通透性并形成肺水腫[21-23]。ERK1/2與細胞的生長、增殖、分化、遷移和存活密切相關(guān)，其激活后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，作用于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞各種生命活動。有研究發(fā)現(xiàn)，在 LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，下調(diào)TLR4表達可以抑制ERK1/2活化，從而減少TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)[24]。本實驗中，模型組肺組織中JNK、ERK、p38磷酸化蛋白表達均升高，BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平也隨著升高。這表明，急性肺損傷模型組小鼠肺組織中JNK、ERK、p38被激活，活化的JNK、ERK、p38蛋白上調(diào)下游炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達。而澤漆水提物高劑量和地塞米松均能下調(diào)小鼠肺組織中JNK、ERK、p38磷酸化蛋白表達，降低BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。這表明澤漆水提物可能通過下調(diào)JNK、ERK、p38蛋白表達，進而抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的異常分泌，減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷肺部炎癥反應(yīng)，改善肺損傷。

綜上所述,本實驗主要揭示了澤漆水提物可以通過干預(yù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及調(diào)控蛋白JNK、p38、ERK1/2的異常表達從而保護LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用機制，為其成為防治急性肺損傷藥物的研發(fā)提供了新思路。