史偉山，王定一，廖新偉

（1.泌陽白云山中西醫(yī)結合醫(yī)院 普外科，河南 駐馬店 463700；2.駐馬店市中心醫(yī)院 普外科，河南 駐馬店 463000）

急性闌尾炎是引起腹痛的最常見原因之一，國內每年有近75 萬次急診和25 萬次闌尾切除術。在全球范圍內，小部分手術是“陰性闌尾切除術”，因誤診導致切除非發(fā)炎的闌尾［1］。目前CT掃描是診斷闌尾炎的“金標準”，對孕婦來講，磁共振成像（MRI）可作為合理的替代檢查，而超聲波檢查可作為初步診斷的替代檢查［2-3］。雖然CT掃描是闌尾炎最敏感和最特異的診斷工具，但具有顯著的輻射暴露問題，在兒童群體中尤其值得關注，因為他們更容易受到輻射暴露的影響。［4］。為減少CT 掃描的損害，幾個臨床試驗正在檢驗低劑量輻射的診斷效用［5-6］。而關于血液生物標志物對急性闌尾炎的診斷相關的研究較少，本研究為找到急性闌尾炎的血液生物標志物，分析了闌尾炎患者和非炎癥腹痛患者的微陣列圖譜。為驗證這些生物標志物在急性闌尾炎患者診斷中的作用，本文對急診室腹痛患者的血液樣本進行了蛋白表達水平的檢測，以期將使用血液生物標志物作為一種急性闌尾炎預篩選方法成為可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2021 年6 月在泌陽白云山中西醫(yī)結合醫(yī)院急診科住院的80 例腹痛患者作為研究對象。其中最終確診為急性闌尾炎的患者46 例為闌尾組，其他原因腹痛的患者34 例為對照組。闌尾組男23 例，女23 例；年齡18～67 歲，平均（43.37±15.25）歲；體質量指數(shù)（BMI）（22.15±1.25）；血白細胞計數(shù)（10.6±1.52）×109/L；長期吸煙者23 例。對照組男17 例，女17 例；年齡18～65 歲，平均（43.46±15.83）歲；BMI（22.32±1.23）；血白細胞計數(shù)（10.8±1.48）×109/L；長期吸煙者17 例。兩組基線資料如性別、年齡、BMI、血白細胞計數(shù)及吸煙情況等比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。該臨床研究符合赫爾辛基宣言，并通過醫(yī)院倫理審查。

1.2 納入排除標準

納入標準：①正在接受急性腹痛評估的患者，包括闌尾炎或疑似腸炎和/或缺血；②闌尾組患者最終由手術及病理證實為急性闌尾炎；③年齡大于18 歲。排除標準：①病危的患者；②導致腹痛的全身惡性疾病患者；③孕婦。

1.3 方法

1.3.1 差異性基因表達 GSE9579 陣列的心臟基因表達譜和相關臨床數(shù)據可從Gene Expression Omnibus（GEO,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載。從診斷為急性闌尾炎的患者中取出的9 個闌尾樣本和因非炎癥原因取出的4 個樣本中評估了基因表達［7］，在每個樣本的遠端獲得一塊圓周組織，根據基因表達譜篩選候選因子；使用Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array 微陣列測量基因表達。另外，根據以下標準篩選差異表達的蛋白質|logFC|＞1 和adj.P＜0.001。

1.3.2 基因富集分析 KEGG 富集分析使用"clusterProfiler"R 包對上述差異基因進行通路富集分析。

1.3.3 蛋白-蛋白互作網絡（PPI）使用在線STRING 對差異基因進行PPI 分析，并將其可視化，然后使用R 語言進行節(jié)點分析。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）①主要試劑：人ADH1C-ELISA 試劑盒購自上海斯信生物科技有限公司，PCK1-ELISA 試劑盒購自上海雙贏生物科技有限公司，MARCO-ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。②主要儀器：離心機（濟南江雪醫(yī)療器械有限公司），恒溫箱（北京福意電器有限公司），酶標儀（濟南貝思網絡技術有限公司）。③實驗方法：采集所有研究對象的空腹靜脈血，靜置分層后，4℃低溫離心機中以3 000 r/min 離心10 min，上層即為血清；根據相應的ELISA 試劑盒說明書測定各組患者血清中酒精脫氫酶1C（ADH1C）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）、膠原結構巨噬細胞受體（MARCO）的含量。

1.4 觀察指標

所有患者均于入組后次日清晨8:00—9:00 空腹狀態(tài)下抽取外周靜脈血，通過ELISA 法檢測血清中ADH1C、PCK1、MARCO 的水平。

檢驗效能采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析，ROC 曲線用于選擇最佳診斷界限值，曲線越靠近左上角，準確性越高。本研究只展現(xiàn)曲線下面積（area under curve,AUC），其用于判斷各檢測指標的診斷效能：AUC＞0.9，為診斷準確性優(yōu)；0.9＞AUC＞0.7，為診斷準確性良好；0.7＞AUC＞0.5，為診斷準確性差；0.5＞AUC，為診斷準確性無臨床意義。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析。計量資料以（）表示，行t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因表達譜篩選候選因子

從GSE25765 數(shù)據集中，進行闌尾炎組與對照組的差異性基因表達，結果發(fā)現(xiàn)ADH1C、PCK1顯著下調，而MARCO 顯著上調，見圖1A。圖1B顯示了利用熱圖將差異基因在每個樣本中表達水平的矩陣。

圖1 基因表達譜篩選候選因子

2.2 差異表達基因的相關功能

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因參與P450-藥物代謝、酪氨酸代謝、丙酮酸代謝、類固醇激素生物合成及PPAR 信號通路等生物學功能。此外，利用在線string 工具可視化上述差異基因間的蛋白-蛋白互相作用網絡（protein-protein interaction network,PPI），其中ADH1C 與其它蛋白節(jié)點間的連線最多，ADH1C 的中心性最高，提示與其它蛋白聯(lián)系緊密，見圖2。

圖2 差異表達基因的相關功能

2.3 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO含量的比較

與對照組相比，闌尾組患者血清中ADH1C、PCK1 含量顯著均較低，MARCO 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比較（n=40,）

表1 兩組患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比較（n=40,）

2.4 各檢測指標對急性闌尾炎的診斷性能

血清ADH1C、PCK1、MARCO 水平對急性闌尾炎分別具有良好的診斷性能（AUC 值＞0.07），見表2。

表2 各檢測指標對急性闌尾炎的診斷性能

3 討論

闌尾炎是一種炎癥性疾病，類似于憩室炎或結腸炎，但某些血液生物標志物的激活是不同的［8］。血液中蛋白的變化模式有助于更好的從生物標志物層面理解急性闌尾炎的病因，有研究認為微生物組16S 區(qū)的下一代測序（NGS），充分表明了梭桿菌的變化與闌尾炎有關［9］。梭桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，可以通過產生丁酸（丁酸鹽）而引起鄰近宿主細胞的毒性反應和小鼠的結腸炎樣癥狀。也有研究試圖開發(fā)血液中闌尾炎的蛋白質生物標志物，如膽紅素、C-反應蛋白（CRP）和降鈣素原（PCT）等。然而對這些生物標志物的研究難以找到理想的臨床預測模型。WBC，CRP 和MRP8/14（S100A8/S100A9）的組合顯示對急性闌尾炎的敏感度為96%，但特異度為43%［10］。同樣，在急性闌尾炎中，由血清淀粉樣蛋白（SAA），髓過氧化物酶（MPO）和MMP9 血漿蛋白水平建立的多變量模型的診斷率低于主要臨床模型（ROC=0.71vs.0.91 臨床模型）［11］。本研究前期通過分析闌尾炎GEO 芯片，發(fā)現(xiàn)表達異常的基因ADH1C、PCK1、MARCO，可能是闌尾炎的潛在生物標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)血清ADH1C、PCK1 水平在急性闌尾炎患者中呈現(xiàn)上調的趨勢，且具有一定的診斷價值。這與ADH1C 是潰瘍性結腸炎最顯著下調的差異性表達基因（DEGs），并且ADH1C 的過表達可以明顯減少白細胞介素（IL）-6 和IL8 產生的結論較為一致［12］，可能為治療潰瘍性結腸炎的潛在靶點。腸道血管屏障（gut-vascular barrier,GVB）的高滲透性在腸道源性敗血癥中起作用，而PCK1在改善GVB 的機制中起重要作用［13］。與我們的研究結果基本一致，PCK1 的下調會導致腸道血管屏障的失調，從而導致闌尾炎癥的發(fā)生。

有研究證實證實肺部炎癥組織中MARCO 水平升高［14］。MARCO 作為跨膜受體，除了吞噬作用外，還是一種粘附質膜受體，它可通過巨胞飲和內吞途徑將各種細胞外物質摻入細胞中發(fā)揮作用［15］。此外，靶向肺癌中免疫抑制性巨噬細胞的MARCO 和IL37R 可阻斷調節(jié)性T 細胞并支持細胞毒性淋巴細胞功能［16］。巨噬細胞被吸引到黏膜炎癥部位，是正常維持屏障功能的主要組成部分，它們對腸道微環(huán)境中的各種可溶性信號有反應，包括缺氧［17］。

目前在市場上用于乳腺癌進展［70 基因預測標記（MammaPrint，Agendia，荷蘭），21 基因復發(fā)評分（Oncotype DX，美國）］、移植排斥反應（AlloMap，美國）和冠狀動脈疾病（CorusCAD）的生物標志物測試產品較多，本研究同樣評估了血液潛在生物標志物對闌尾炎的診斷效能，認為盡管蛋白質生物標志物會由于其他高豐度蛋白質的干擾而難以測量，但相對于mRNA 標志物來說，其檢測相對較快、易于應用于臨床，因而仍然具有開發(fā)價值。

綜上所述，闌尾細菌生物膜可能是闌尾炎的一個重要病理生理機制，ADH1C、PCK1、MARCO在急性闌尾炎患者中變化顯著，對急性闌尾炎的臨床診斷具有一定指導意義。