徐紅梅，李發(fā)家，王亮

（1.蘇州凱瑞斯生物科技有限公司，江蘇 張家港 215600；2.江蘇艾迪爾醫(yī)療科技股份有限公司，江蘇 張家港 215600）

聚氨酯（PU）創(chuàng)面敷料具有材質(zhì)柔軟，孔徑大小均勻，吸濕透氣高吸收性等優(yōu)點(diǎn)，其多孔層狀的結(jié)構(gòu)有利于排出創(chuàng)面產(chǎn)生的分泌物，能夠抵御外界細(xì)菌的侵入，防止創(chuàng)面受到細(xì)菌的感染，促進(jìn)傷口在一個相對濕潤的微環(huán)境中快速愈合［1-3］；另外因其具有良好的韌性和彈性、加工性能好、加工方式多樣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于潰瘍創(chuàng)面、創(chuàng)傷創(chuàng)面等方面的治療［4-5］，在臨床上對于急性創(chuàng)面、慢性難愈合創(chuàng)面及外科手術(shù)后滲出液較多的創(chuàng)面等情況，聚氨酯創(chuàng)面敷料多與負(fù)壓吸引裝置聯(lián)合使用，能夠加快創(chuàng)面的愈合，大大減少感染的概率，在臨床上得到廣泛的使用［6］。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測是食品、生物醫(yī)藥、醫(yī)療器械等行業(yè)必不可少的安全檢測手段［7-8］。如若創(chuàng)面敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量超標(biāo)輕則會引起機(jī)體的發(fā)熱，重則當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素在進(jìn)入人體血液中的濃度足夠大時會引起更嚴(yán)重的安全問題，如敗血癥性休克，從而導(dǎo)致死亡。因此為了避免創(chuàng)面敷料在生產(chǎn)過程中引入的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，保證產(chǎn)品在實(shí)際使用中的安全性，有必要對其細(xì)菌內(nèi)毒素的含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)可知［9-10］，目前細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法主要分為凝膠法和光度法［11-12］。最常用的檢測方法是凝膠法，鱟試劑中的凝固酶和凝固蛋白原能夠被微量的細(xì)菌內(nèi)毒素激活，其中凝固酶被激活轉(zhuǎn)化成具有活性的凝固酶原，繼而使可溶性的凝固蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白而最終形成凝膠，這便是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）的作用機(jī)理［13］。該文采用凝膠法對聚氨酯創(chuàng)面敷料進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，通過對鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)及凝膠限度試驗(yàn)，建立該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，為不同規(guī)格型號的該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所使用的材料與試劑見表1。

表1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

研究所使用的儀器與設(shè)備見表2。

表2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 器具處理 試驗(yàn)過程中所用到的所有玻璃器皿需為耐高溫材質(zhì)制成，全部清洗干凈之后放入潔凈的不銹鋼滅菌盒內(nèi)，經(jīng)過250℃烘烤1 h 除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，避免試驗(yàn)過程假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。如若使用非金屬以及不耐高溫玻璃材質(zhì)的器具，應(yīng)該選用對試驗(yàn)過程無干擾的標(biāo)明無內(nèi)毒素的器具，如微孔板和吸頭等。

1.3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 根據(jù)YY/T0618 標(biāo)準(zhǔn)［14］，對于醫(yī)療器械而言，每件器械內(nèi)毒素限值K＜20 EU，取3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料（Y2004006、Y2004013、Y2004028），根據(jù)創(chuàng)面敷料的規(guī)格（300×200×30）mm 設(shè)定每件的沖洗液總量V 為600 mL，根據(jù)公式，試驗(yàn)液內(nèi)毒素限值=KN/V，計(jì)算可得在該沖洗量的情況下該規(guī)格的聚氨酯創(chuàng)面敷料的試驗(yàn)液內(nèi)毒素限值為0.033 EU/mL，以此限度進(jìn)行聚氨酯創(chuàng)面敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素方法研究。

1.3.3 聚氨酯創(chuàng)面敷料最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 根據(jù)公式：MVD=CL/λ，其中L 為聚氨酯創(chuàng)面敷料的試驗(yàn)內(nèi)毒素限值0.033 EU/mL，C 為聚氨酯創(chuàng)面敷料浸提液的濃度，即為1.0 mL/mL，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，此次試驗(yàn)采用兩種廠家生產(chǎn)的靈敏度均為0.03 EU/mL 的鱟試劑，則該規(guī)格的聚氨酯創(chuàng)面敷料試驗(yàn)液的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）為1 倍，即為該供試品600 mL 浸提液原液。

2 結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)2020 版《中華人民共和國藥典》［10］中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對兩種廠家生產(chǎn)的靈敏度均為0.03 EU/mL 的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。具體試驗(yàn)結(jié)果見表3，結(jié)果顯示兩種生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的標(biāo)示靈敏度λ 為0.03 EU/mL 的鱟試劑的λc分別是0.025 EU/mL 和0.03 EU/mL，均在0.5 λ～2 λ 之間，均符合要求，即可證明這兩種鱟試劑均可用于供試品的干擾試驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)。

表3 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.2 干擾試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱蓑?yàn)證供試品在一定濃度或者一定量的浸提液中，鱟試劑與內(nèi)毒素的凝膠反應(yīng)是否受到干擾［15］。當(dāng)鱟試劑或者供試品的生產(chǎn)廠家、配方、生產(chǎn)工藝以及試驗(yàn)環(huán)境等發(fā)生了其他有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，需要重新做干擾試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分別將3 批的聚氨酯創(chuàng)面敷料置無熱原玻璃器皿或者無熱原取樣袋內(nèi)，分別加600 mL BET 水振搖數(shù)次，在（37±1）℃恒溫箱中浸泡浸提不少于1 h，即得聚氨酯創(chuàng)面敷料浸提液，供試品的浸提液貯存周期應(yīng)≤2 h，本次試驗(yàn)分別采用符合上述靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的兩種生產(chǎn)廠家的0.03 EU/mL 鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)。具體試驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料的浸提液對這兩種鱟試劑生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的0.03 EU/mL 的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均不存在干擾作用，均不影響其凝膠反應(yīng)，即ES均在0.5 λ～2 λ 之間，Et均在0.5 ES～2 ES之間，則證明可在該600 mL 浸提液下對此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合要求。

表4 聚氨酯創(chuàng)面敷料的干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.3 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠限度試驗(yàn)

用這兩種鱟試劑分別對3 個批次的聚氨酯創(chuàng)面敷料的浸提液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，具體檢測結(jié)果見表5。結(jié)果表明，用0.03 EU/mL 靈敏度的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料的浸提液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合要求，即可證明該3 批創(chuàng)面敷料的浸提液試驗(yàn)內(nèi)毒素含量小于0.033 EU/mL，聚氨酯創(chuàng)面敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于20 EU/件，符合要求。

表5 聚氨酯創(chuàng)面敷料細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

本研究采用首先對兩種不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑（0.03 EU/mL）的靈敏度分別進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)，然后對3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料（300 mm×200 mm×30 mm）的干擾試驗(yàn)及細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠限度進(jìn)行試驗(yàn)，建立了聚氨酯創(chuàng)面敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果證明兩種不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑（0.03 EU/mL）的靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定；然后分別采用這兩種0.03 EU/mL 的鱟試劑對3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料進(jìn)行干擾試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果證明該規(guī)格的聚氨酯創(chuàng)面敷料在600 mL 的沖洗量的情況下對鱟試劑反應(yīng)無干擾作用，確定所采用的方法可行；再對該試驗(yàn)條件下的3 批聚氨酯創(chuàng)面敷料進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，結(jié)果均符合規(guī)定。證明該檢測方法適用于聚氨酯創(chuàng)面敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測，具有可行性。對于不同規(guī)格的聚氨酯創(chuàng)面敷料應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定沖洗量，繼而確定試驗(yàn)內(nèi)毒素限值。