張維義，趙 雪，徐幸蓮

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇高校肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

乳液是指一種液體（分散相）以液滴形式分散在另一種與其不相溶的液體（連續(xù)相）中形成的混合分散體系。根據(jù)分散相和連續(xù)相性質(zhì)的不同，可將乳液劃分為水包油（O/W）型乳液和油包水（W/O）型乳液，其中O/W型乳液在食品行業(yè)中更為常見(jiàn)，如牛奶、蛋黃醬、稀奶油等。在乳液制備過(guò)程中，通常需要加入兩親性的乳化劑，使分散相穩(wěn)定存在于連續(xù)相中。作為天然兩親性生物大分子，動(dòng)/植物源蛋白質(zhì)是一類高效的乳化劑。蛋白質(zhì)分子表面既含有非極性的疏水基團(tuán)，也含有極性的親水基團(tuán)，因此可以在乳液制備過(guò)程中吸附于油-水界面，形成蛋白界面膜（protein interfacial film，PIF），降低界面張力。同時(shí)，蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)以及空間構(gòu)象使得形成的PIF能提供有效的靜電斥力和空間位阻效應(yīng)，進(jìn)一步阻止油滴的聚集。

由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液本身屬于熱不穩(wěn)定體系，并且PIF對(duì)環(huán)境（如pH值、離子強(qiáng)度、溫度等）變化十分敏感，因此蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液在貯藏過(guò)程中易發(fā)生絮凝、聚結(jié)、乳析、奧氏熟化等失穩(wěn)現(xiàn)象，使體系向低自由能方向運(yùn)動(dòng)，最終導(dǎo)致兩相分離，乳液穩(wěn)定性和理化性質(zhì)隨之下降，進(jìn)而影響界面介導(dǎo)的食品均一化和標(biāo)準(zhǔn)化，降低了相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)價(jià)值。因此，需要采取手段有效提升蛋白質(zhì)乳液的穩(wěn)定性并改善其理化特性。

目前使用較為廣泛的提升乳液穩(wěn)定性的方法是在乳化前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)修飾，使其結(jié)構(gòu)與分散程度發(fā)生變化，進(jìn)而改善其乳化特性，如添加其他功能性成分（多糖、多酚、酶類等）、氧化修飾（金屬催化的氧化反應(yīng)、肌紅蛋白催化的氧化反應(yīng)等）以及采用新型食品加工技術(shù)（超聲波、高壓均質(zhì)、脈沖電場(chǎng)等）。然而，許多經(jīng)過(guò)預(yù)修飾的蛋白易形成高分子質(zhì)量的多分支聚合物，使相互之間的空間位阻作用增強(qiáng)，因此在吸附過(guò)程中大量預(yù)修飾蛋白分子彼此相互排斥而無(wú)法直接與界面相互作用，從而導(dǎo)致界面覆蓋率降低。此外，預(yù)修飾蛋白在乳化過(guò)程中向油-水界面擴(kuò)散及吸附的速率會(huì)下降，從而可能導(dǎo)致乳化活性降低。因此，蛋白預(yù)修飾技術(shù)雖然研究深入且應(yīng)用廣泛，但仍具有一定局限性。與傳統(tǒng)的預(yù)修飾法不同，蛋白界面修飾直接作用于乳化后的界面蛋白，通過(guò)酶促交聯(lián)、多糖接枝、多酚結(jié)合等手段修飾界面蛋白結(jié)構(gòu)并改變相鄰界面蛋白交聯(lián)程度，從而提高PIF黏彈性以及覆蓋率。經(jīng)過(guò)界面修飾而形成的高機(jī)械強(qiáng)度PIF可更有效防止乳液絮凝、聚結(jié)等失穩(wěn)現(xiàn)象的發(fā)生，同時(shí)可作為保護(hù)層進(jìn)一步抑制油脂氧化，從而改善乳液的理化特性。并且蛋白界面修飾可有效規(guī)避上述預(yù)修飾法中存在的不利因素，因而作為一種新興技術(shù)得到研究者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)階段，蛋白界面修飾相關(guān)研究尚缺乏系統(tǒng)性和完整性的闡釋?；诖耍疚募芯C述了目前主要的蛋白界面修飾方法及其對(duì)O/W型乳液特性的改善效果，并對(duì)蛋白界面修飾領(lǐng)域的未來(lái)進(jìn)行展望，以期為乳液特性的進(jìn)一步改善提供新的思路。

1 酶促交聯(lián)修飾

目前應(yīng)用于界面蛋白酶促交聯(lián)修飾的酶主要有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），其中后者包括漆酶、酪氨酸酶等。酶促交聯(lián)修飾的具體操作方式通常是向乳液中加入適量的酶，隨后在37 ℃條件下振蕩使體系充分反應(yīng)，通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)時(shí)間或體系內(nèi)氧消耗量從而終止反應(yīng)，最后將得到的界面修飾乳液在4 ℃條件下靜置20～24 h使體系穩(wěn)定。該方法穩(wěn)定性較好，反應(yīng)過(guò)程易控制，因此使用較為廣泛。

1.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

TGase是一種?；D(zhuǎn)移酶，它可以催化谷氨酰胺（?；w）上的-酰胺基團(tuán)向游離氨基酸（?；荏w）轉(zhuǎn)移。在蛋白質(zhì)中，賴氨酸殘基的-氨基通常作為?；荏w，從而形成谷氨酰胺-賴氨酸鍵，使蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)或分子間共價(jià)交聯(lián)（圖1），從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能特性進(jìn)行改善。因此，TGase可能主要通過(guò)以下方式在乳化后對(duì)乳液體系中界面蛋白進(jìn)行修飾從而改善乳液特性：1）TGase能夠催化同一油滴界面蛋白之間通過(guò)共價(jià)鍵形成交聯(lián)，促進(jìn)界面蛋白分子有序定向，形成更穩(wěn)定的PIF；2）促進(jìn)不同油滴界面上的吸附蛋白、吸附蛋白與未吸附蛋白之間形成共價(jià)交聯(lián)，增加PIF厚度，改善乳液空間結(jié)構(gòu)均一性。在后者作用下，乳液還可轉(zhuǎn)化為乳液凝膠，進(jìn)一步提升了乳液的穩(wěn)定性。因此TGase在對(duì)食品級(jí)乳液體系中大分子蛋白進(jìn)行界面修飾，從而改善乳液的功能特性方面有極大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，TGase誘導(dǎo)形成的乳液凝膠也在生產(chǎn)靶向遞送、定點(diǎn)釋放的功能性乳液載體方面得到了應(yīng)用。

圖1 TGase催化的反應(yīng)Fig. 1 Reactions catalyzed by transglutaminase

Noriki等于1986年首次發(fā)現(xiàn)，酪蛋白、11S大豆蛋白和7S大豆球蛋白穩(wěn)定的乳液體系與TGase一起孵育時(shí)，乳液黏度增加，并將這一現(xiàn)象歸因于油-水界面蛋白分子內(nèi)和分子間谷氨酰胺-賴氨酸鍵的形成。研究表明，乳化后階段中TGase界面修飾大豆球蛋白/-伴大豆球蛋白乳液后，雖然部分油滴發(fā)生了絮凝，但相比于未修飾乳液，界面修飾乳液形成了機(jī)械強(qiáng)度更高的PIF，穩(wěn)定性顯著提升。此外，乳液中油相比例增加時(shí)界面區(qū)域相應(yīng)增加，使得TGase能更高效地催化相鄰油滴界面上的蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，形成厚且完整的PIF，從而提升乳液穩(wěn)定性。Alavi等在乳化后階段利用TGase處理熱變性雞蛋白蛋白（thermal denatured egg white protein，TD-EWP）乳液時(shí)發(fā)現(xiàn)油-水界面上的TD-EWP在TGase作用下發(fā)生了高效的交聯(lián)作用，并且這種交聯(lián)作用隨著TGase濃度升高而提升，界面修飾顯著提升了乳液的機(jī)械特性和流變特性。TGase還可通過(guò)修飾界面蛋白提高乳液消化特性，這是由于TGase能夠催化界面乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）形成共價(jià)交聯(lián)，防止乳液在模擬胃腸液中出現(xiàn)絮凝和聚結(jié)，降低界面蛋白水解程度，從而有利于包埋活性成分的有效釋放。研究人員對(duì)界面鷹嘴豆蛋白（chickpea protein，CP）進(jìn)行修飾時(shí)也得出相同的結(jié)論，在TGase的共價(jià)交聯(lián)作用下，胰蛋白酶底物——賴氨酸殘基受共價(jià)聚合物保護(hù)，避免乳化后界面CP在胰液素中被胰蛋白酶水解，乳液的穩(wěn)定性與包埋性質(zhì)顯著提升。綜上所述，乳液體系中的界面蛋白經(jīng)TGase修飾后，與相鄰界面蛋白或未吸附蛋白形成共價(jià)交聯(lián)，使得乳液結(jié)構(gòu)更加均一并形成更加穩(wěn)定的保護(hù)膜，改善了乳液的質(zhì)構(gòu)特性和功能特性。因此，TGase在蛋白界面修飾領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，TGase于1998年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證為一般安全（generally recognized as safe，GRAS）等級(jí)，其介導(dǎo)的蛋白界面修飾反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物或造成營(yíng)養(yǎng)成分的損失，并且對(duì)乳液的風(fēng)味影響也較小。但是，由于TGase提取及純化的成本較高，因此將TGase介導(dǎo)的蛋白界面修飾應(yīng)用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)仍有一定難度。

1.2 多酚氧化酶類

1.2.1 漆酶

漆酶是一種主要來(lái)源于柑橘類植物、原核生物或真菌的氧化還原酶，其活性位點(diǎn)處含有4個(gè)銅原子，可以催化多酚、甲氧基取代苯酚、苯胺等芳香型底物的氧化反應(yīng)。近年來(lái)，漆酶作為蛋白質(zhì)交聯(lián)劑被廣泛應(yīng)用于蛋白界面修飾領(lǐng)域的研究中。由于蛋白質(zhì)中的酚類基團(tuán)并不是漆酶催化反應(yīng)的最適底物，而有些結(jié)構(gòu)緊密的球狀蛋白如-乳球蛋白（-lactoglobulin，-Lg）吸附在界面時(shí)不可直接被漆酶作用，因此通常需要向反應(yīng)體系中加入酚類介質(zhì)作為電子傳導(dǎo)載體。在氧作用下，漆酶將酚類底物轉(zhuǎn)化為初級(jí)氧化產(chǎn)物，這種氧化產(chǎn)物是一種不穩(wěn)定的活性芳香自由基，可以攻擊界面蛋白中的酪氨酸活性殘基，使其與相鄰界面蛋白、未吸附蛋白或酚類介質(zhì)發(fā)生交聯(lián)（圖2），從而對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾。

圖2 漆酶催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)Fig. 2 Crosslinking of proteins catalyzed by laccase

在酚類介質(zhì)香草酸存在的條件下，乳化后形成的油-水界面WPI在漆酶作用下能夠與連續(xù)相中的未吸附蛋白形成共價(jià)交聯(lián)，使得乳液PIF變厚，提供了更強(qiáng)的空間位阻效應(yīng)，阻礙了油滴的碰撞和絮凝，從而使整個(gè)體系在貯藏期間內(nèi)始終保持穩(wěn)定。通過(guò)界面修飾改善發(fā)酵奶的加工特性，能夠使脂肪液滴界面上的乳蛋白在漆酶作用下由酚類介質(zhì)香草酸和咖啡酸介導(dǎo)形成共價(jià)交聯(lián)，使得酸奶的剪切黏彈性增加，這種改善效果隨著酶含量和酚類介質(zhì)含量的增加而越發(fā)明顯。然而，Mokoonlall等發(fā)現(xiàn)漆酶處理發(fā)酵奶對(duì)其黏彈性和儲(chǔ)能模量均沒(méi)有顯著改善作用，這可能是因?yàn)槿橐后w系中乳蛋白在交聯(lián)前先發(fā)生了降解。Zeeb等結(jié)合層層靜電自組裝（layer-bylayer，LBL）技術(shù)和漆酶酶促交聯(lián)法在乳化后階段對(duì)明膠穩(wěn)定的乳液進(jìn)行界面修飾，首先使果膠（含有阿魏酸，一種酚類介質(zhì)）通過(guò)靜電引力作用自動(dòng)沉積在乳化后形成的界面明膠上，然后在漆酶作用下使果膠與明膠之間產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，這種經(jīng)過(guò)雙重界面修飾的明膠乳液在消化道內(nèi)具有更高的穩(wěn)定性，同時(shí)可以在小腸內(nèi)定向釋放包埋的活性物質(zhì)。Chen Pusen等也證明在甜菜果膠（sugar beet pectin，SBP）存在的條件下，界面修飾乳液的界面張力與Zeta-電位（負(fù)值）降低，黏稠度與穩(wěn)定性增加，這是由于漆酶可誘導(dǎo)界面椰子肉蛋白與界面及連續(xù)相SBP產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，形成均一的乳液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，防止油滴上浮而出現(xiàn)分層。因此，漆酶可以誘導(dǎo)界面蛋白交聯(lián)而改善乳液理化特性，并且酚類介質(zhì)可以促進(jìn)漆酶修飾效果。

利用漆酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行界面修飾的優(yōu)點(diǎn)之一是其對(duì)環(huán)境友好，漆酶誘導(dǎo)的氧化交聯(lián)反應(yīng)以O(shè)為電子受體，并且副產(chǎn)物主要為HO，因此不會(huì)對(duì)環(huán)境造成過(guò)度污染。此外，漆酶修飾的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其作用底物廣泛，如上文所述的香草酸、咖啡酸以及SBP等均可作為酚類底物，在漆酶催化下對(duì)界面蛋白進(jìn)行修飾。但是，漆酶的活性易受pH值以及抑制劑的影響，如漆酶僅在酸性條件下穩(wěn)定，同時(shí)Fe、Ag、Al等離子會(huì)抑制漆酶活性，這在一定程度上限制了其在蛋白界面修飾領(lǐng)域的適用范圍。

1.2.2 酪氨酸酶

酪氨酸酶是一類廣泛存在于大自然中的氧化酶，其活性位點(diǎn)處含有一對(duì)銅離子。酪氨酸酶的作用底物與漆酶相似，在酪氨酸酶的催化下，酚類物質(zhì)被空氣中的氧氣氧化為鄰二酚，并進(jìn)一步形成鄰二醌。活性鄰二醌可以與不同基團(tuán)（如胺基、酰胺基、巰基）反應(yīng)，形成分子內(nèi)或分子間共價(jià)交聯(lián)。由于蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中發(fā)生解折疊，酪氨酸殘基中酚類基團(tuán)暴露，因此乳化后階段酪氨酸酶可以在不添加酚類介質(zhì)的條件下直接作用于該位點(diǎn)，通過(guò)引入芳烷基、耦合芳氧基自由基或形成雙酪氨酸結(jié)構(gòu)使界面蛋白交聯(lián)（圖3），能夠改善PIF強(qiáng)度與乳液空間結(jié)構(gòu)，提升乳液理化特性。同時(shí)，由于體系中無(wú)需添加酚類介質(zhì)，可以避免蛋白與酚類介質(zhì)過(guò)度交聯(lián)而影響界面吸附或破壞乳液均一性。

圖3 酪氨酸酶催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)Fig. 3 Crosslinking of proteins catalyzed by tyrosinase

Isaschar-Ovdat等在不含酚類介質(zhì)條件下利用酪氨酸酶在乳化后修飾界面大豆球蛋白，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶誘導(dǎo)的界面修飾使更多未吸附蛋白與界面蛋白形成共價(jià)交聯(lián)，從而提升了蛋白界面吸附率，并且界面修飾乳液具有更高的黏性和更低的乳析速率，在48 h的貯藏期間內(nèi)始終保持穩(wěn)定，而經(jīng)過(guò)乳化前預(yù)修飾的乳液在24 h內(nèi)即出現(xiàn)了分層的現(xiàn)象。然而，部分研究認(rèn)為酚類介質(zhì)可以促進(jìn)酶類的界面修飾作用，這是由于結(jié)構(gòu)緊密的球狀蛋白在吸附前后結(jié)構(gòu)變化不顯著，因此需要添加酚類介質(zhì)誘導(dǎo)酶促界面修飾的發(fā)生。此外，酶的作用時(shí)間也會(huì)影響界面修飾乳液的最終品質(zhì)，Glusac等在乳化后階段利用酪氨酸酶修飾界面馬鈴薯蛋白（potato protein，PP），發(fā)現(xiàn)PP穩(wěn)定的乳液在與酪氨酸酶共同作用1 h內(nèi)，相鄰油滴表面的PP之間產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，使油滴相互靠近，乳液形成了自持型乳液凝膠結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性提升；但是隨著作用時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，乳液凝膠結(jié)構(gòu)開(kāi)始崩塌，黏度顯著降低。這表明在合適的作用時(shí)間內(nèi)，酪氨酸酶可以通過(guò)對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾而改善乳液理化特性，但作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)起到相反的效果，因?yàn)檫^(guò)度催化會(huì)破壞界面PP交聯(lián)聚集體和油滴聚集網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使乳液品質(zhì)下降。

與漆酶相似，酪氨酸酶介導(dǎo)的蛋白界面修飾不會(huì)產(chǎn)生有害環(huán)境的化合物；并且其作用底物廣泛，可以誘導(dǎo)多種含酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)在界面上發(fā)生交聯(lián)，適用范圍較廣。但是，在反應(yīng)體系存在鄰二醌的條件下，酪氨酸酶催化的界面修飾過(guò)程不易控制，易產(chǎn)生單體酚或低聚酚等復(fù)合物；并且酪氨酸酶在界面修飾過(guò)程中還易產(chǎn)生黑色素，造成乳液褐變，影響乳液的感官品質(zhì)。

2 多糖修飾

多糖疏水性和黏性較高，具有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可通過(guò)非共價(jià)和共價(jià)作用力與界面蛋白相互交聯(lián)而改變蛋白結(jié)構(gòu)和功能，因此多糖可應(yīng)用于大分子蛋白界面修飾領(lǐng)域，改善乳液理化特性。

2.1 非共價(jià)交聯(lián)修飾

驅(qū)動(dòng)多糖與蛋白之間形成非共價(jià)結(jié)合的作用力主要有靜電作用力、疏水作用力、氫鍵、范德華力等。目前在對(duì)大分子蛋白進(jìn)行界面修飾方面研究最深入、應(yīng)用最廣泛的技術(shù)是基于靜電作用力的LBL技術(shù)。LBL技術(shù)是指先使一種帶電乳化劑（如蛋白質(zhì)）在乳化過(guò)程中吸附在乳液界面上作為初級(jí)吸附層（primary layer），此時(shí)的乳液稱為初級(jí)乳液（primary emulsion）；然后再在乳液中加入一種與“初級(jí)吸附層”乳化劑帶有相反電荷的生物大分子（如多糖），利用兩者之間的靜電吸引作用，使得后者自動(dòng)沉積在初級(jí)吸附層上，形成二級(jí)吸附層（secondary layer）與二級(jí)乳液（secondary emulsion）。以此類推，還可通過(guò)加入第三種帶電生物大分子，形成三級(jí)吸附層（tertiary layer），制備三級(jí)乳液（tertiary emulsion）。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在環(huán)境pH值與自身等電點(diǎn)pI相等的條件下，其分子表面所帶凈電荷為零；在環(huán)境pH＜pI條件下，其分子表面帶正電荷；而在環(huán)境pH＞pI條件下，其分子表面帶負(fù)電荷。因此，可以通過(guò)調(diào)整乳液體系pH值，使帶正或負(fù)電荷的蛋白質(zhì)首先在乳化過(guò)程中吸附在油-水界面上，形成油滴外第一層保護(hù)膜；然后在乳化后體系中加入相反電荷的多糖，利用LBL技術(shù)使其通過(guò)靜電作用力自動(dòng)沉積在先前吸附的界面蛋白上，從而形成第二層保護(hù)膜，對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾。

目前基于LBL技術(shù)制備多糖界面修飾乳液的具體途徑有3種。1）浸潤(rùn)法：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值（如以-電勢(shì)為判斷依據(jù)）向乳液體系中直接加入足量多糖以覆蓋油滴表面的蛋白吸附層。該方法中，加入的多糖量不易控制，易發(fā)生橋聯(lián)絮凝和損耗絮凝的現(xiàn)象。2）離心法：向乳液體系中加入過(guò)量多糖以確保油滴表面蛋白吸附層被浸潤(rùn)，并通過(guò)離心除去連續(xù)相中的過(guò)量多糖。通過(guò)重復(fù)上述步驟以提升多糖在界面蛋白層的靜電沉積量。該方法的缺陷是乳液中油滴顆?？赡軙?huì)在離心力的驅(qū)動(dòng)下發(fā)生聚集。3）過(guò)濾法：不同于離心法，該方法通過(guò)膜過(guò)濾以除去連續(xù)相中的過(guò)量多糖。在該方法中，油滴顆粒不會(huì)在外力作用下相互碰撞，因此通過(guò)該法制備的界面修飾乳液不易發(fā)生絮凝或聚結(jié)等現(xiàn)象。

許多研究證實(shí)，相比于傳統(tǒng)的單吸附層乳液，多層乳液對(duì)不利環(huán)境因素有更好的抗性，在長(zhǎng)期貯藏期間表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，這是因?yàn)榈鞍?多糖聚合物既可以通過(guò)蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)穩(wěn)定地錨定在油-水界面上，形成機(jī)械強(qiáng)度較高的保護(hù)膜，又可以通過(guò)多糖所帶的負(fù)電荷和各種分支側(cè)鏈分別提供的靜電斥力與空間位阻效應(yīng)，防止油滴的絮凝和聚結(jié)。同時(shí)，蛋白-多糖復(fù)合層的形成增加了油-水界面膜的厚度與密度，從而能更有效地防止油滴在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中相互碰撞而聚集，并可作為保護(hù)屏障抑制乳液體系中促氧化劑與油脂的接觸。此外，多糖與界面蛋白所形成緊密且低流動(dòng)性的界面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加了乳液的界面剪切黏性，提高了界面蛋白膜在外界環(huán)境變化條件下的穩(wěn)定性。

由于自然界中存在的多糖大多是陰離子多糖，因此目前研究多集中于以正電荷蛋白質(zhì)為初級(jí)吸附層，而將陰離子多糖作為二級(jí)吸附層與界面蛋白通過(guò)靜電作用力相結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行界面修飾從而改善乳液特性。研究表明，通過(guò)LBL技術(shù)結(jié)合高速剪切作用，利用高甲氧基果膠對(duì)乳化后油滴界面上的7S伴大豆球蛋白膜進(jìn)行修飾，形成的多層乳液體系具有較厚的界面層結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出較好的長(zhǎng)期貯藏穩(wěn)定性?；贚BL技術(shù)利用黃芪膠對(duì)WPI進(jìn)行乳化后界面修飾，發(fā)現(xiàn)相比于直接由WPI-黃芪膠穩(wěn)定的預(yù)修飾乳液，前者具有更小的粒徑與更高的表觀黏度。這是因?yàn)樵谌榛敖?jīng)過(guò)預(yù)修飾形成的WPI-黃芪膠復(fù)合物降低了乳化過(guò)程中的超聲效率，同時(shí)在超聲波的作用下該復(fù)合物易誘導(dǎo)油滴發(fā)生橋聯(lián)絮凝，使得乳化前預(yù)修飾乳液的穩(wěn)定性降低。在-Lg乳液中，分別以-卡拉膠與明膠相繼對(duì)乳化后界面-Lg進(jìn)行修飾制備二級(jí)和三級(jí)乳液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在反復(fù)的凍結(jié)-解凍過(guò)程中，僅三級(jí)乳液未發(fā)生油滴聚集和乳液分層的現(xiàn)象。這是由于三級(jí)乳液油滴外的界面層較厚，抑制了凍結(jié)-解凍過(guò)程中油滴的絮凝傾向，同時(shí)也保護(hù)了油滴不被冰晶所破壞。然而，Güzey等利用果膠與殼聚糖相繼對(duì)-Lg乳液進(jìn)行界面修飾時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然二級(jí)乳液（-Lg-果膠）和三級(jí)乳液（-Lg-果膠-殼聚糖）相比于初級(jí)乳液都能在高溫下有效抑制油滴絮凝和乳液分層，但二級(jí)乳液有著更廣泛的熱穩(wěn)定溫度范圍。這可能是因?yàn)槿?jí)乳液界面上的果膠-殼聚糖聚合物在高溫下發(fā)生了部分脫落，從而被相鄰油滴界面共享而產(chǎn)生了類似橋聯(lián)絮凝的現(xiàn)象，因而導(dǎo)致三級(jí)乳液高溫穩(wěn)定性降低。綜上可知，經(jīng)過(guò)界面修飾的二級(jí)乳液和三級(jí)乳液理化特性都有顯著改善，但是二級(jí)乳液與三級(jí)乳液之間的穩(wěn)定性差異與多糖種類、濃度、相互作用和界面修飾順序等有關(guān)。

作為自然界中唯一存在的陽(yáng)離子多糖，殼聚糖也可修飾乳液界面蛋白而改善乳液特性。在殼聚糖介導(dǎo)的界面修飾體系中，首先加入負(fù)電荷蛋白質(zhì)使其吸附于乳液界面，隨后加入陽(yáng)離子殼聚糖，后者通過(guò)靜電吸引作用對(duì)界面蛋白進(jìn)行修飾。Liu Chang等發(fā)現(xiàn)殼聚糖與界面蠶豆蛋白通過(guò)靜電吸引作用相結(jié)合后，界面蛋白吸附量增加并且在界面上分布更加均勻，乳液界面層厚度與緊密性顯著提高，因此乳液的絮凝和聚結(jié)程度降低，貯藏穩(wěn)定性相比于乳化前預(yù)修飾乳液顯著提升。同時(shí)，殼聚糖介導(dǎo)的界面修飾還可通過(guò)以下機(jī)制抑制乳液體系中油脂氧化，提高乳液化學(xué)穩(wěn)定性：1）殼聚糖靜電沉積于界面蛋白層后可以促進(jìn)后者在油-水界面穩(wěn)定且均勻分布，進(jìn)而阻止促氧化劑與油滴直接接觸；2）提高界面層的厚度與黏彈性，延緩O或促氧化劑向界面的擴(kuò)散；3）通過(guò)提高蛋白質(zhì)界面吸附量并減小油滴粒徑，從而降低油滴與O或促氧化劑接觸的表面積。此外，Liu Chang等在研究殼聚糖界面修飾對(duì)乳液特性的改善效果時(shí)還發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可作為保護(hù)層降低界面蛋白氧化水平，進(jìn)一步提高乳液的感官品質(zhì)、化學(xué)穩(wěn)定性與食用安全性。

2.2 共價(jià)交聯(lián)修飾

雖然多糖可以通過(guò)非共價(jià)靜電吸引力沉積在界面蛋白膜上，對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾，改善乳液的特性，但這種靜電吸引力很容易受pH值、離子強(qiáng)度影響而減弱，使多糖層脫落，從而導(dǎo)致油滴聚集，使乳液再次失穩(wěn)。與之相較，多糖與界面蛋白之間的共價(jià)交聯(lián)能在外界環(huán)境變化下保持穩(wěn)定，進(jìn)一步提高乳液穩(wěn)定性。目前使用較為廣泛的是酶促共價(jià)交聯(lián)修飾，由1.2節(jié)內(nèi)容可知，氧化酶類可以在乳化后階段作用于界面蛋白中的酚類基團(tuán)，使PIF形成交聯(lián)。而當(dāng)多糖中含有酚類基團(tuán)時(shí)，其可作為酚類介質(zhì)，在氧化酶類催化下與乳化后界面蛋白之間形成共價(jià)交聯(lián)，對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾。如在漆酶和O存在條件下，多糖中的酚類基團(tuán)被轉(zhuǎn)化為活性芳香自由基，從而與含酪氨酸殘基的界面蛋白相互交聯(lián)；而在過(guò)氧化物酶和HO存在條件下，多糖中的酚類基團(tuán)被奪取單電子后形成酚氧自由基，隨后酚氧自由基通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)形成醌類物質(zhì)，進(jìn)而與含有氨基或巰基基團(tuán)的界面蛋白相互交聯(lián)。經(jīng)過(guò)多糖共價(jià)修飾后，PIF厚度和黏彈性增加，界面蛋白吸附量提升，形成共聚性的界面保護(hù)層；并且經(jīng)共價(jià)交聯(lián)修飾形成的多糖層不易脫落，使乳液在內(nèi)、外界環(huán)境變化的條件下仍能保持穩(wěn)定。

SBP含有阿魏酸，因此可作為酚類介質(zhì)參與氧化酶類催化的界面蛋白交聯(lián)反應(yīng)。Zeeb等以明膠作為乳化劑制備初級(jí)乳液，然后加入SBP使其通過(guò)LBL技術(shù)沉積在油滴界面的明膠保護(hù)膜上形成二級(jí)乳液，最后向二級(jí)乳液中加入漆酶，使SBP與明膠形成共價(jià)交聯(lián)，從而對(duì)界面蛋白進(jìn)行共價(jià)多糖修飾。相比于初級(jí)乳液和二級(jí)乳液，經(jīng)過(guò)共價(jià)交聯(lián)處理后的乳液對(duì)鹽離子、pH值、熱處理以及凍結(jié)-解凍循環(huán)處理有更好的穩(wěn)定性，這是因?yàn)槿榛蟮慕缑婷髂z經(jīng)過(guò)修飾與SBP形成了更加緊密的保護(hù)層，可防止油滴的絮凝和聚結(jié)。同時(shí)相關(guān)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)共價(jià)交聯(lián)發(fā)生在同一油滴外的兩層吸附層（明膠與SBP）之間，而非發(fā)生在相鄰油滴之間。也有學(xué)者在乳化后對(duì)WPI進(jìn)行多糖共價(jià)界面修飾，并研究其對(duì)乳液特性的影響，如Li Jinlong和Zeeb等分別利用辣根過(guò)氧化物酶和漆酶的催化作用，使乳液界面WPI與SBP產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，并得出相似的結(jié)論：經(jīng)過(guò)共價(jià)交聯(lián)的WPI-SBP乳液，相比于僅通過(guò)LBL技術(shù)制備的二級(jí)乳液，能在更廣泛的pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，在氧化酶的作用下，界面蛋白與多糖之間的非共價(jià)結(jié)合轉(zhuǎn)化為共價(jià)結(jié)合，防止多糖因pH值或離子強(qiáng)度變化而從界面蛋白層上解離，增加了界面吸附層的機(jī)械強(qiáng)度，乳液也因此表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

3 多酚修飾

酚類物質(zhì)是一類在植物中大量存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征是苯環(huán)上連接有一個(gè)或多個(gè)酚羥基，其中后者又稱為多酚。在食品行業(yè)中應(yīng)用較為廣泛的多酚有綠原酸、兒茶酚、阿魏酸、咖啡酸和姜黃素等。多酚可以在乳化后階段與界面蛋白以共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合，從而提升界面膜厚度與強(qiáng)度，防止O滲透氧化油滴，并提供有效的空間位阻作用以防止油滴之間相互碰撞。同時(shí)，多酚還可促進(jìn)界面蛋白解折疊而暴露出內(nèi)部的疏水基團(tuán)或帶電基團(tuán)，增加界面蛋白與相鄰界面蛋白或未吸附蛋白之間的交聯(lián)程度以提升PIF共聚性。經(jīng)多酚界面修飾后的乳液，黏度增加，且不易發(fā)生絮凝和聚結(jié)，物理穩(wěn)定性顯著提升，油脂氧化程度顯著降低。此外，多酚本身也具有抗氧化活性，與多酚交聯(lián)后的PIF可進(jìn)一步防止油滴氧化，提高乳液的品質(zhì)。相比于在乳化前階段對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多酚預(yù)修飾，乳化后對(duì)PIF進(jìn)行多酚界面修飾能更有效提升乳液穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)乳化前預(yù)修飾的蛋白質(zhì)與多酚形成較大的聚集體，向界面擴(kuò)散的速率降低，乳化特性受到一定程度的影響，貯藏過(guò)程中物理穩(wěn)定性低于界面修飾乳液；而在界面修飾過(guò)程中，蛋白質(zhì)首先吸附于界面，隨后在多酚的作用下相互交聯(lián)，形成更穩(wěn)定的界面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而有效抑制乳液油滴聚結(jié)，減小乳液粒徑。

多酚主要通過(guò)酶促交聯(lián)法和自由基誘導(dǎo)法與界面蛋白形成共價(jià)交聯(lián)。酶促交聯(lián)是指多酚在PPO的催化下，被環(huán)境中的O氧化為鄰二酚，鄰二酚進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為活性鄰二醌，后者可以與界面蛋白親核氨基酸殘基（甲硫氨酸、賴氨酸、色氨酸以及半胱氨酸）共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)其進(jìn)行修飾（圖4），Ma Hairan等在乳化后階段通過(guò)PPO誘導(dǎo)多酚類物質(zhì)香草酸與界面WPI共價(jià)交聯(lián)，增加了PIF厚度，有效防止了乳液油滴在貯藏期間內(nèi)絮凝。自由基誘導(dǎo)法需要借助自由基攻擊界面蛋白，使其暴露出側(cè)鏈親核氨基酸殘基并與多酚共價(jià)交聯(lián)。Intarasirisawat等則直接以氧化多酚作為促氧化劑，引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使多酚在乳化后階段與界面蛋白形成共價(jià)交聯(lián)，賦予PIF更高的強(qiáng)度，降低了乳液的粒徑。同時(shí)，產(chǎn)生的適量自由基不僅沒(méi)有氧化油滴，反而進(jìn)一步誘導(dǎo)界面蛋白與相鄰界面蛋白以及多酚交聯(lián)，形成更厚的PIF，阻止O滲透進(jìn)入油滴，因此乳液的氧化穩(wěn)定性顯著提升。

圖4 酶促交聯(lián)法誘導(dǎo)的蛋白-多酚共價(jià)交聯(lián)Fig. 4 Covalent conjugation of proteins and polyphenols catalyzed by enzymatic reactions

此外，多酚還可非共價(jià)作用于界面蛋白，從而改善乳液特性。多酚與界面蛋白間的非共價(jià)相互作用主要有疏水作用力、氫鍵、靜電作用力等。疏水作用力通常發(fā)生在界面蛋白疏水氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等）與多酚的非極性芳香環(huán)之間；氫鍵主要發(fā)生在多酚的羥基（—OH）與界面蛋白羧基（—COOH）以及氨基（—NH）之間；靜電作用力主要發(fā)生在界面蛋白帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸的-氨基）與多酚帶負(fù)電荷的—OH之間。Fuhrmann等發(fā)現(xiàn)原花青素可促進(jìn)界面WPI三級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)以暴露出疏水側(cè)鏈基團(tuán)，從而與界面蛋白分子之間通過(guò)疏水作用力、氫鍵以及靜電作用相結(jié)合，增加PIF厚度；同時(shí)，相鄰界面蛋白分子之間也可通過(guò)疏水作用力相互交聯(lián)，形成更緊密的界面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)原花青素界面修飾后的WPI乳液，雖然油滴發(fā)生部分聚集，但是表觀黏度顯著提升，穩(wěn)定性增加。

Intarasirisawat等發(fā)現(xiàn)在乳化后向魚(yú)卵蛋白水解物穩(wěn)定的乳液中添加氧化單寧酸（oxidised tannic acid，OTA）進(jìn)行界面修飾，乳液的粒徑顯著低于未修飾乳液和預(yù)修飾乳液，并在14 d內(nèi)保持了良好的貯藏穩(wěn)定性。OTA的加入可改善PIF的結(jié)構(gòu)，有助于促進(jìn)界面蛋白之間相互交聯(lián)，形成機(jī)械強(qiáng)度更高的保護(hù)膜，抑制油滴的絮凝和聚結(jié)并降低粒徑。然而，乳液體系中蛋白濃度過(guò)高時(shí)，多酚修飾會(huì)增加乳液粒徑。這是由于界面達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，連續(xù)相中存在大量未吸附蛋白，此時(shí)多酚誘導(dǎo)的交聯(lián)不僅發(fā)生在界面蛋白之間，也發(fā)生在界面蛋白與未吸附蛋白之間，使得吸附層變厚，從而導(dǎo)致粒徑增大。由此可見(jiàn)，界面修飾乳液的粒徑與蛋白濃度有關(guān)。總體而言，界面修飾能顯著提升乳液貯藏穩(wěn)定性，當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時(shí)，界面蛋白之間相互交聯(lián)，PIF機(jī)械強(qiáng)度提高，使PIF在外界環(huán)境條件變化時(shí)仍能保持完整，有效抑制油滴的絮凝和聚結(jié)；而當(dāng)?shù)鞍诐舛容^高時(shí)，界面蛋白與未吸附蛋白交聯(lián)，形成更厚、更穩(wěn)定的PIF，提供了更有效的空間位阻效應(yīng)，同樣能更好地抑制油滴絮凝和聚結(jié)，較厚的界面膜還能阻止O與油滴接觸，有效地抑制了油滴的氧化，延長(zhǎng)了乳液貯藏期。

結(jié)合上述相關(guān)研究的結(jié)果和推論可以初步了解多酚修飾界面蛋白的途徑與機(jī)制。目前，多酚界面修飾的具體操作方式通常是向乳液中加入適量多酚，通過(guò)高壓均質(zhì)等物理方式使體系充分混合，或通過(guò)酶、促氧化劑等誘導(dǎo)反應(yīng)發(fā)生，并將最終的界面修飾乳液在室溫下靜置一段時(shí)間使體系穩(wěn)定。但是，有關(guān)多酚對(duì)大分子蛋白界面修飾的研究仍然較少，多酚-界面蛋白相互作用影響乳液性質(zhì)的機(jī)制還不明確，不同多酚與不同界面蛋白相互作用對(duì)乳液性質(zhì)的影響尚未闡明，多酚濃度、界面蛋白濃度以及未吸附蛋白濃度與界面修飾的互作關(guān)系等科學(xué)問(wèn)題都亟需繼續(xù)探索。

4 氧化修飾

近年來(lái)，氧化修飾對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改善逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注。蛋白質(zhì)氧化是指活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）直接誘導(dǎo)或在氧應(yīng)激條件下產(chǎn)生的次級(jí)副產(chǎn)物間接誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)共價(jià)修飾現(xiàn)象，其中以ROS直接誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)為主。

5 結(jié) 語(yǔ)

蛋白界面修飾在20世紀(jì)末受到一定的關(guān)注（如通過(guò)LBL技術(shù)制備多層乳液），但截至目前該領(lǐng)域仍缺乏深入研究和系統(tǒng)總結(jié)。本文綜述了目前使用較為廣泛的幾種蛋白界面修飾方法：酶促交聯(lián)修飾、多糖修飾、多酚修飾和氧化修飾，并介紹了以上方法的機(jī)制及對(duì)乳液特性的改善效果。乳液界面蛋白經(jīng)過(guò)修飾后，可通過(guò)共價(jià)作用或非共價(jià)作用與相鄰界面蛋白、未吸附蛋白或其他修飾物質(zhì)形成交聯(lián)，形成緊密度更強(qiáng)、吸附量更高的界面蛋白膜，通過(guò)防止油滴聚結(jié)、氧氣滲透等，提升乳液的貯藏穩(wěn)定性、消化穩(wěn)定性或氧化穩(wěn)定性。但由上文所述內(nèi)容可以發(fā)現(xiàn)，蛋白界面修飾領(lǐng)域仍有很大的發(fā)展空間。首先，未來(lái)需進(jìn)一步優(yōu)化各類界面修飾方法的具體操作方式與反應(yīng)條件以提高該項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的可行性。如對(duì)于酶促交聯(lián)修飾、多糖修飾、多酚修飾，需進(jìn)一步研究體系中酶、多糖和多酚的適宜添加量，并進(jìn)一步確定反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)終止條件，從而提升乳液特性的改善效果；而對(duì)于氧化修飾，需更精確測(cè)定界面蛋白發(fā)生修飾所需的自由基含量并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間加以控制，從而防止自由基過(guò)量對(duì)蛋白質(zhì)和油相產(chǎn)生不利的影響。其次，目前界面修飾方法較為單一，主要集中于化學(xué)手段，未來(lái)需進(jìn)一步研究如何將化學(xué)修飾法與物理修飾法（如超聲波、高靜壓、高壓均質(zhì)等）相結(jié)合，以拓寬界面修飾應(yīng)用范圍并進(jìn)一步提升界面修飾效果。此外，經(jīng)過(guò)界面修飾的乳液雖然各種理化特性得到改善，但其消化性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，以保證最終產(chǎn)品的安全性。鑒于乳液體系的復(fù)雜性，很難預(yù)測(cè)多相之間的互作機(jī)制，因此對(duì)蛋白進(jìn)行界面修飾確實(shí)存在一定的困難，但是先前的研究成果為后續(xù)繼續(xù)探索提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，并證實(shí)大分子蛋白界面修飾改善乳液特性具有可行性，在未來(lái)必將有廣泛的應(yīng)用前景。