趙鵬娟，歸 萌，徐 宇，李澤鵬，馮文智，郝士軍，余麗麗**

(1.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

刺激敏感型聚合物指能夠對環(huán)境變化作出響應的一類功能性高分子材料，常見的刺激因素有pH值[1]、溫度[2]、光照[3]、氧化還原電位[4-5]、葡萄糖[6]等。該類材料由于其良好的結構可控性，常被設計用于功能性藥物載體材料，尤其是藥物控釋材料。光是一種清潔、無創(chuàng)、有效、可控的刺激源，光敏感型藥物載體材料可通過調節(jié)光強、光照時間和刺激部位，實現(xiàn)藥物在病灶部位有效控釋，從而達到藥物靶向釋放的目的[3]。光敏感型藥物載體材料可通過在結構中引入光敏感型基團來實現(xiàn)，常見的敏感型基團主要有光致斷裂型(如鄰硝基芐基氧和香豆素基團等)、光致異構型(如螺吡喃)、光致重排型(如2-重氮-1,2-萘醌基團)、光致交聯(lián)型(如香豆素、肉桂酸)[3,7-8]。

糖是人體重要的生物信息分子，在細胞分化、黏附和增殖等許多重要的生理過程發(fā)揮著關鍵作用。在靶向型藥物輸送體系研究中，含糖載體受到了廣泛的關注[9]。Song等[10]合成了一系列含糖藥物載體(包括含半乳糖)，并通過熒光標記的方式驗證了其對肺泡巨噬細胞的識別。Pearson等[11]則研究了含半乳糖載體對人黑色素瘤細胞的靶向識別作用。

作者以含鄰硝基芐基氧的交聯(lián)劑為光敏感型交聯(lián)劑，設計合成了一種梳形含半乳糖的兩親聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]，并研究了其結構和光敏感性能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，天津市津北精細化工有限公司；碳酸鉀：分析純，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；甲基丙烯酸聚乙二醇酯500(PEGMA 500)、甲基丙烯酸聚乙二醇酯300(PEGMA 300)：化學純，山東德彥化工有限公司；硼氫化鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠；鄰硝基苯乙酮：純度98%，溴化亞銅：純度99.5%，溴化銅：純度99.5%，乳糖酸(LA)：純度97%，甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DAEMA)：純度99.5%，叔丁氧羰基乙醇胺(Boc-乙醇胺)：純度98%，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)：純度99.5%，薩恩化學技術(上海)有限公司；3-溴丙酰氯：純度>95%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；碘化鉀：純度99%，上海竺鑰化工有限公司；尼羅紅(NR)：純度97.5%，甲基丙烯酸甲酯(MMA)：純度99.8%，N,N,N,N,N-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)：純度98%，北京百靈威科技有限公司。

傅里葉變換紅外光譜儀：TENSOR-27，德國布魯克公司；熒光分光光度計：LS55，Perkin Elmer公司；馬爾文激光粒度儀：ZEN3600，英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 光敏感交聯(lián)劑和自由基聚合引發(fā)劑的合成

光敏感交聯(lián)劑和自由基引發(fā)劑的合成路線見圖1。

a 光敏感交聯(lián)劑

b 自由基引發(fā)劑圖1 光敏感交聯(lián)劑和自由基引發(fā)劑的合成路線

由圖1a可知，以鄰硝基苯乙酮為初始原料，通過α-溴代、還原環(huán)合、開環(huán)、酯化獲得了二溴代的光敏感交聯(lián)劑[12]。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：8.02(dd,J=8.2,1.2 Hz,1H),7.91(dd,J=7.9,1.3 Hz,1H),7.76～7.64(m,1H),7.56～7.45(m,1H),5.63(dd,J=7.2,3.3 Hz,1H),4.41(dd,J=11.4,7.3 Hz,1H),4.19(t,J=6.3 Hz,1H),3.59(dd,J=6.6,3.8,2.6 Hz,4H),3.14～2.80(m,4H)。

由圖1b可知，以Boc-乙醇胺為原料通過酯化和脫保護合成了含氨基的自由基引發(fā)劑，具體操作如下。取Boc-乙醇胺(2.61 g，0.016 2 mmol)在冰浴中加入2,6-二甲基吡啶(2.77 g，0.025 9 mmol)和20 mL無水二氯甲烷，將2-溴-2-甲基丙酰溴(5.38 g，0.023 4 mmol)溶于9 mL無水二氯甲烷中，用滴液漏斗緩慢滴至體系中。室溫攪拌反應4 h，用飽和NaHCO3洗滌(3次)，無水硫酸鈉干燥、減壓濃縮后用乙酸乙酯-正己烷在-70 ℃下結晶得引發(fā)劑1(4.106 g)，產(chǎn)率100%。取引發(fā)劑1(0.8 g，0.6 mmol)加入4 mL三氟乙酸(TFA)，常溫攪拌4 h后減壓濃縮至油狀物，加少量二氯甲烷，-30 ℃下用乙醚重結晶，得白色晶體，得引發(fā)劑2(0.602 g)，產(chǎn)率75.3%。

1.3 半乳糖修飾的兩親聚合物[LA-PEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成

兩親聚合物[LA-PEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成見圖2，具體實驗過程通過以下4步完成。

圖2 含光敏感交聯(lián)劑的兩親聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成路線

1.3.1 氨基封端的親水端(NH2-PPEGMA-Br)的合成

取0.260 g的引發(fā)劑2于聚合反應管(見圖2)中，加入6 mL的1,4-二氧六環(huán)使其溶解，加入0.591 g PEGMA 500、3.949 1 g PEGMA 300、58.4 mg溴化亞銅和0.140 g PMDETA后，封閉反應管，進行冷凍-抽真空-充氮氣-解凍，循環(huán)4次，于90 ℃下反應6 h，通空氣停止反應。以二氯甲烷為流動相過中性氧化鋁柱，減壓濃縮得綠色黏稠狀固體。溶于0.5 mL的二氯甲烷后在5 mL正己烷中沉降3次，得到0.23 g NH2-PPEGMA-Br。

1.3.2 氨基封端的兩親聚合物[NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)]的合成

取254 mg NH2-PPEGMA-Br于聚合反應管中，加入3 mL 1,4-二氧六環(huán)使其溶解，加入0.528 5 g(5.279 mmol)的MMA、0.476 7 g(3.032 mmol)的DAEMA、42 μL的PMDETA以及29.5 mg(0.206 mmol)的溴化亞銅，封閉反應管，進行冷凍-抽真空-充氮氣-解凍，循環(huán)4次，于90 ℃下反應過夜。以四氫呋喃為流動相過中性氧化鋁柱，濃縮后，溶于0.5 mL二氯甲烷后在5 mL正己烷中沉降3次，得到0.2 g NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)。

1.3.3 半乳糖修飾的兩親聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)]的合成

稱取200 mg(0.558 mmol)乳糖酸，90 mg(0.237 mmol)HATU于聚合反應管中，加入20 mL 二甲基亞砜，再加入92 μL的三乙胺，此時溶液呈現(xiàn)黃色。稱取223.5 mg NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)，加入5 mL二甲基亞砜溶解后，加入至上述體系中，攪拌過夜，此時溶液呈黃綠色。用截留分子量為500 Da的透析袋在雙蒸水中透析24 h至溶液呈乳白色，濃縮即得100 mg LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)。

1.3.4 含光敏感交聯(lián)劑的兩親聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]的合成

取0.1 g的LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)溶于丙酮后加入4 mg的碘化鉀和10 mg交聯(lián)劑，于80 ℃加熱回流20 h，冷卻至室溫，減壓濃縮，加入0.5 mL的四氫呋喃在5 mL石油醚中沉降3次，得80 mg產(chǎn)物。

1.4 結構表征

取微量樣品[NH2-PPEGMA-Br、NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)、LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)、LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]粉末，與光譜純溴化鉀充分研磨后壓片，通過傅里葉變換紅外光譜儀測定其紅外光譜。將樣品溶于氘代氯仿后測定1H NMR。

1.5 載NR膠束的構建、臨界膠束濃度(CMC)值的測定和光敏感性

以DMF為溶劑配置ρ(聚合物)=10 mg/mL母液和ρ(NR)=1 mg/mL母液，取一定量的聚合物母液加入500 μL NR母液，以5～6滴/min的速度緩慢滴加1 mL蒸餾水后，常溫攪拌6 h，再加入9 mL的蒸餾水，透析(截留分子量8 000～14 000 Da)2 d，定容至15 mL，即得載NR的膠束。將ρ(聚合物)分別稀釋至0.001～0.3 mg/mL，在543 nm的激發(fā)波長處，采用熒光分光光度計測定其熒光強度，繪圖獲得CMC值。

1.6 光敏感性研究

測定載NR膠束在不同pH值(pH=2.2～10.0)下和不同光照時間(t=0～20 min)的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 結構表征

采用FTIR和1H NMR表征了聚合物的結構,聚合物的紅外光譜圖見圖3。

σ/cm-1—NH2-PPEGMA-Br；—NH2-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)；—LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)；—LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL圖3 聚合物的紅外譜圖

由圖3可知，1 728 cm-1為聚合后形成的飽和脂肪酸酯羰基的伸縮振動吸收峰，1 155 cm-1歸屬于PEG結構的飽和脂肪醚C—O—C伸縮振動吸收峰，1 106 cm-1則歸屬于叔胺的C—N伸縮振動吸收峰。LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL紅外圖譜中出現(xiàn)的1 530 cm-1的吸收峰歸屬于交聯(lián)劑的芳香族的—NO2反對稱伸縮吸收峰，證明了交聯(lián)劑的順利接入。

聚合物的1H NMR圖譜見圖4。

由圖4a可知，δ=4.11歸屬于PEG酯端聯(lián)接亞甲基的氫(—OCOCH2—)、MMA酯結構中的甲基氫(—OCOCH3)、以及DAEMA酯結構中的亞甲基氫(—OCOCH2—)、δ=1.66～1.90為DAEMA和聚合物骨架中亞甲基的氫，δ=0.87～0.91為骨架中的—CH3氫信號。約δ=3.85的信號則歸屬于半乳糖氫。由圖4b可知，δ=7.52～8.04的氫信號歸屬于交聯(lián)劑的苯環(huán)氫。

δa 聚合物骨架的氫信號

δb 聚合物中交聯(lián)劑的芳香環(huán)氫信號圖4 聚合物的1H NMR譜

2.2 膠束的形成

兩親分子在水中形成膠束所需的最低濃度稱為臨界膠束濃度(CMC)。NR是一種脂溶性熒光染料，在極性環(huán)境中NR幾乎不溶，熒光強度很弱，而在非極性環(huán)境中，NR的溶解度較高，其熒光強度會顯著增強，因此，可作為熒光探針用于CMC值的測定，見圖5。

λ/nma 不同濃度聚合物包載NR的熒光光譜

logcb 630.6 nm下熒光發(fā)射強度和logc之間的關系圖5 兩親聚合物的CMC值測定

由圖5a可知，聚合物在低濃度條件下，體系的熒光弱，隨著聚合物濃度的增加，體系的熒光強度不斷增強，這是由于在低聚合物濃度條件下，體系中無膠束，水體系中熒光強度較弱，隨著聚合物濃度提高，滿足表面吸附后的聚合物進入水體系中自組裝形成膠束，NR溶于膠束的脂溶性中心，表現(xiàn)出較強的熒光強度。由圖5b可知，隨著聚合物濃度的提高，I值從7.4增加到460，表明在該濃度范圍內聚合物發(fā)生了膠束化的變化，通過求拐點得到聚合物的CMC值為0.062 9 mg/mL。采用動態(tài)光散射檢測了膠束的粒徑和電位，測得該膠束的粒徑為359.2 nm(PDI為0.394)，Zeta電位為27.9 mV，可見該膠束帶正電，且膠束的電位大于25 mV，應該具有較強的分散性和穩(wěn)定性。

2.3 不同的pH值下光敏感性的研究

實驗研究了載NR膠束在光照條件下熒光強度的變化，熒光強度降低代表著膠束中載負的熒光分子被釋放，結果見圖6、圖7。

λ/nma pH=2.2

λ/nmb pH=5.0

λ/nmc pH=6.5

λ/nmd pH=7.4

λ/nme pH=10.0圖6 膠束光敏感性研究

由圖6可知，在強酸性條件下(pH=2.2)隨著光照的進行，體系熒光強度增強，可能是由于酸性條件下聚合物結構中的叔胺結構發(fā)生質子化形成季銨鹽結構，鏈段間的排斥力增強，使得膠束發(fā)生溶脹，而隨著光照時間的進行，體系的溫度上升，促進了溶脹和質子化的發(fā)生使得膠束的包載空間和能力均增強，因此出現(xiàn)熒光強度增強的現(xiàn)象。在相對較弱的酸性條件下(pH=5.0)也出現(xiàn)相類似的趨勢，但是熒光強度增大趨勢下降。

pH圖7 光照時間對熒光強度的影響

由圖7可知，pH=6.5、7.4，隨著光照的延長，膠束的熒光強度基本呈下降趨勢，這是由于在接近中性的環(huán)境中，叔胺結構發(fā)生質子化的比率下降，隨著光照時間的增加，光敏感性交聯(lián)劑發(fā)生斷裂造成了膠束結構疏松從而使得包載進去的NR更易釋放出來。而在堿性條件下(pH=10.0)，隨著光照時間的延長，該膠束的熒光強度呈上升趨勢?？赡苁且驗樵趬A性條件下去質子化，使膠束結構更為緊密，抵抗了光敏感基團的斷裂對藥物釋放的促進作用，同時光照的熱量反而增加了NR的溶解性能，所以引起熒光強度的線性上升。

3 結 論

(1)以鄰硝基苯乙酮為原料通過α-溴代、還原環(huán)合、開環(huán)、酯化等過程獲得了二溴代的光敏感交聯(lián)劑；

(2)以Boc-乙醇胺為原料通過酯化和脫保護獲得了含氨基的自由基引發(fā)劑；

(3)通過兩步原子轉移自由基聚合、?；磻?、烷基化反應合成含光敏感交聯(lián)劑的兩親聚合物[LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL]，并采用1H NMR、FTIR對其合成過程進行了表征；

(4)以LA-PPEGMA-P(MMA-co-DAEMA)-CL為原料制備了空白膠束和載NR膠束，并采用激光粒度儀表征了膠束的粒徑和帶電情況，發(fā)現(xiàn)膠束的粒徑約為359.2 nm，粒子表面帶正電；

(5)研究顯示，在中性介質中膠束具有光敏感性能，在光照的刺激下能夠釋放其中的脂溶性包載物。