左 丹 曹佳穎 邱藝杰 王含章 田曉梵 王文平 董 怡

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，約占肝惡性腫瘤的85%，外科手術(shù)是最理想的根治性治療手段，然而80%的HCC 患者在術(shù)后3～5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)［1］。微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）是HCC 術(shù)后早期復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，與患者總體生存率及無進(jìn)展生存期密切相關(guān)［2］。MVI 也稱微血管癌栓，是指顯微鏡下在癌旁肝組織微血管腔內(nèi)見到癌細(xì)胞巢團(tuán)［3］，目前尚無有效的術(shù)前影像學(xué)預(yù)測手段，僅能根據(jù)術(shù)后標(biāo)本的病理結(jié)果進(jìn)行判斷。超聲造影（contrastenhanced ultrasound，CEUS）作為一項安全、無創(chuàng)的影像學(xué)檢查方法，可以敏感地顯示病灶內(nèi)微循環(huán)血流灌注，已廣泛應(yīng)用于HCC 的臨床診治［4］。Sonazoid 是一種肝臟特異性超聲造影劑，其特有的枯否期（血管后期）通過巨噬細(xì)胞特異性的吞噬作用，實現(xiàn)了HCC 的特異性成像及診斷［5］。影像組學(xué)通過對超聲影像的高通量信息挖掘、深度學(xué)習(xí)及量化分析，常用于腫瘤的精準(zhǔn)診斷及療效評估，是近年來國內(nèi)外研究的熱點［6-9］。本研究通過構(gòu)建基于Sonazoid CEUS 枯否期圖像的影像組學(xué)預(yù)測模型，旨在探討其在術(shù)前預(yù)測HCC病灶MVI的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、研究對象

前瞻性納入2021年4～8月我院擬診為肝惡性腫瘤且擬行手術(shù)治療的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18 歲，能配合CEUS 檢查；②擬診為肝惡性腫瘤，擬于我院肝外科接受手術(shù)治療；③術(shù)前1 周于我院超聲科行肝臟常規(guī)超聲及Sonazoid CEUS 檢查；④既往未接受其他治療，包括放療、化療、靶向治療及介入治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過手術(shù)治療；②最終手術(shù)病理結(jié)果顯示非HCC；③肝臟占位在灰階條件或造影條件下顯示不清；④肝內(nèi)多發(fā)病灶；⑤病灶最大徑＞5 cm；⑥無法在一幀超聲圖像上同時顯示完整病灶及病灶周圍5 mm 的正常肝實質(zhì)；⑦患者要求退出研究。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、儀器與方法

1.超聲檢查：使用西門子Acuson Sequoia彩色多普勒超聲診斷儀，5C-1 腹部探頭，頻率1～6 MHz。造影劑使用Sonazoid（GE 醫(yī)療集團(tuán)），使用前每支凍干劑加入2.0 ml生理鹽水振蕩配置成混懸液備用。首先行灰階超聲觀察病灶位置、大小、形態(tài)、邊緣及內(nèi)部回聲特征，CDFI觀察病灶內(nèi)血流情況。然后將探頭保持在能清晰顯示病灶及其周圍5 mm肝實質(zhì)的最佳切面，切換至超聲造影模式，囑患者平靜呼吸，經(jīng)肘正中靜脈團(tuán)注造影劑混懸液0.5 ml，隨后立即用5.0 ml 生理鹽水沖管，連續(xù)觀察造影劑在病灶動脈期、門脈期、延遲期及枯否期的增強(qiáng)、消退表現(xiàn)，并留存連續(xù)2 min 的動態(tài)圖像及枯否期的靜態(tài)圖像。以上操作均由具有5年及以上肝臟CEUS檢查經(jīng)驗的超聲醫(yī)師完成。

2.臨床資料獲?。河涗浰谢颊叩幕拘畔⒓靶g(shù)前腫瘤標(biāo)記物水平，包括性別、年齡和血清甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原19-9、甲胎蛋白異質(zhì)體、異常凝血酶原、微小核糖核酸水平。

3.術(shù)后隨訪：隨訪所有患者的病理結(jié)果，記錄HCC病灶的MVI情況。根據(jù)2015年《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》標(biāo)準(zhǔn)［3］，即顯微鏡下是否于癌周微血管腔內(nèi)觀察到癌細(xì)胞巢團(tuán)，將病灶分為MVI 陰性（未見癌細(xì)胞巢團(tuán)）和MVI 陽性（見癌細(xì)胞巢團(tuán)，無論數(shù)量及出現(xiàn)范圍）。

三、構(gòu)建基于Sonazoid CEUS 枯否期圖像的影像組學(xué)模型

1.標(biāo)注感興趣區(qū)（ROI）：將儲存的Sonazoid CEUS圖像導(dǎo)入3D-Slicer 軟件（版本：Slicer-4.11.20200930，slicer.）進(jìn)行ROI 標(biāo)注。將ROI 覆蓋整個腫瘤，在灰階超聲圖像及CEUS 枯否期圖像上對病灶進(jìn)行勾畫。病灶周圍5 mm 區(qū)域由Slicer 軟件ROI 外擴(kuò)功能生成，最終ROI 來自灰階超聲圖像及枯否期圖像的腫瘤區(qū)域（TR）、瘤周5 mm 區(qū)域（PR）及腫瘤+瘤周5 mm 區(qū)域（ER），分別以灰階TR、灰階PR、灰階ER、枯否期TR、枯否期PR和枯否期ER表示，見圖1。對于外擴(kuò)后ROI覆蓋的非肝臟部位區(qū)域進(jìn)行手動刪除。以上操作均由兩名具有5 年及以上肝臟CEUS 檢查經(jīng)驗的超聲醫(yī)師完成。

圖1 感興趣區(qū)標(biāo)注示意圖

2.提取及篩選影像組學(xué)特征：將ROI 內(nèi)的超聲圖像轉(zhuǎn)為灰度圖，并以2 為組距對灰度值進(jìn)行離散化。依據(jù)圖像生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化倡議，分別從灰階超聲圖像及枯否期圖像的TR、PR 及ER 提取形態(tài)學(xué)、一階直方圖和二階紋理學(xué)影像組學(xué)特征。高階影像組學(xué)特征包括高斯拉普拉斯特征、小波變換特征及局部二值特征，由對原始灰階圖像相應(yīng)特征變換后的衍生圖像計算得出。在初始標(biāo)注1 個月后，由其中一名超聲醫(yī)師對隨機(jī)選取的10 例患者圖像再次進(jìn)行ROI 標(biāo)注。通過計算兩名醫(yī)師分別標(biāo)注的ROI及同一醫(yī)師在不同時間標(biāo)注的ROI所提取的影像組學(xué)特征的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）及一致性相關(guān)系數(shù)（CCC），確定并排除不穩(wěn)定的影像組學(xué)特征（ICC＜0.75 或CCC＜0.90）。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用單變量邏輯回歸再次篩選特征，最后通過最大相關(guān)最小冗余算法和LASSO 正則回歸篩選出具有預(yù)測效力的候選特征。

3.構(gòu)建模型：將上述篩選出的候選特征通過向后逐步回歸法篩選出的6 個區(qū)域最具預(yù)測價值的特征，通過支持向量機(jī)法分別構(gòu)建6個影像組學(xué)模型。通過影像組學(xué)模型計算出每例患者的風(fēng)險概率，視為影像組學(xué)評分，評分越接近1，代表該患者M(jìn)VI 風(fēng)險更高。然后篩選出在MVI 陰性和MVI 陽性病例中差異有統(tǒng)計學(xué)意義且在單因素Logistic 回歸中為獨立預(yù)測變量的臨床信息和影像組學(xué)評分，通過多因素Logistic回歸構(gòu)建臨床影像組學(xué)模型。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Python 3.8 統(tǒng)計軟件，缺失或離群值均用群體均值替代。連續(xù)性變量的正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk檢驗法，符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量以±s表示，非正態(tài)分布的連續(xù)性變量以M（Q1，Q3）表示；分類變量以頻數(shù)或百分比表示。95%可信區(qū)間由1000 次自舉法重采樣得出。模型的效能評估采用留一交互驗證法。繪制受試者工作特征（ROC）曲線評估各模型預(yù)測HCC 病灶MVI 的效能，曲線下面積比較采用Delong 檢驗。采用決策曲線評估各模型的臨床收益。所有單因素統(tǒng)計學(xué)檢驗中雙邊P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，多變量Logistic 回歸中P＜0.1 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、納入患者臨床資料

最終共50例患者納入研究，均經(jīng)手術(shù)病理證實為單發(fā)HCC，其中男41 例，女9 例，年齡28～83 歲，平均（57.62±11.77）歲，甲胎蛋白為8.20（3.10，105.42）ng/ml，癌胚抗原為1.85（1.40，2.90）ng/ml，糖類抗原19-9 為12.75（8.20，17.70）ng/ml，甲 胎 蛋 白 異 質(zhì) 體 為7.40（0.55，35.62）%，異 常 凝 血 酶 原 為107.50（30.25，1792.25）mAU/ml，微小核糖核酸陽性38例、陰性12例，MVI陽性31例、MVI陰性19例。

二、各影像組學(xué)模型的預(yù)測效能比較

從灰階超聲圖像和枯否期圖像的TR、PR 及ER 中各提取1125個影像組學(xué)特征，分別剔除239、154、169、382、197和409個不穩(wěn)定特征。通過進(jìn)一步篩選，最終篩選出5 個最具預(yù)測效力的影像組學(xué)特征，分別構(gòu)建基于灰階TR、灰階PR、灰階ER、枯否期TR、枯否期PR和枯否期ER特征的影像組學(xué)模型。

6 個影像組學(xué)模型中，以枯否期PR 影像組學(xué)模型對MVI 的獨立預(yù)測效能最佳，其ROC 曲線下面積為0.834，準(zhǔn)確率為84.0%，敏感性為90.3%，特異性為73.7%。見表1和圖2。

圖2 各影像組學(xué)模型預(yù)測MVI的ROC曲線圖

表1 各影像組學(xué)模型對MVI的預(yù)測效能比較

三、各臨床影像組學(xué)模型的預(yù)測效能比較

1.單因素Logistic 回歸分析顯示，所有影像組學(xué)評分均與MVI 病理結(jié)果顯著相關(guān)。納入所有預(yù)測變量的多因素Logistic 回歸分析顯示，僅枯否期PR 影像組學(xué)評分為MVI的獨立預(yù)測因素。見表2，3。

表2 風(fēng)險變量單因素Logistic回歸分析

表3 風(fēng)險變量多因素Logistic回歸分析

2.決策曲線分析顯示，當(dāng)模型預(yù)測MVI 概率閾值為0.05～0.85 時，枯否期PR 影像組學(xué)評分較其他影像組學(xué)評分能夠提供更高的臨床收益。見圖3。

圖3 臨床模型與臨床影像組學(xué)模型決策曲線圖

討論

MVI 是目前公認(rèn)的與HCC 復(fù)發(fā)及預(yù)后直接相關(guān)的危險因素。以往研究［2，8，10-11］應(yīng)用CT 或MRI 影像特征來預(yù)測HCC 病灶是否伴有MVI，結(jié)果顯示HCC 病灶包膜不完整、邊界不清、動脈期邊緣強(qiáng)化或包膜強(qiáng)化、肝膽特異期腫瘤周圍低增強(qiáng)均為MVI 陽性的高危因素。但CT和MRI僅通過間接的影像特征來預(yù)測MVI，且CT檢查具有放射性，MRI檢查價格昂貴，造影劑通過腎臟代謝且容易出現(xiàn)造影劑過敏反應(yīng)等，臨床應(yīng)用局限。

影像組學(xué)通過提取圖像中與形狀、像素強(qiáng)度分布和紋理特征等相關(guān)的信息，能定量反映腫瘤的異質(zhì)性。近年來，基于術(shù)前預(yù)測HCC 病灶MVI的影像組學(xué)研究主要基于CT 及MRI圖像，敏感性為75%～81%，特異性79%～92%，其中腫瘤大小和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)的特征預(yù)測術(shù)前MVI 的價值最高［6，12-13］。不同增強(qiáng)時期影像組學(xué)模型的預(yù)測效能不同，在CT 檢查中，門脈期影像組學(xué)模型表現(xiàn)優(yōu)于動脈期和延遲期；而在MRI 檢查中，基于動脈期的影像組學(xué)模型預(yù)測效能最高［6，12-13］。但CT 或MRI 影像組學(xué)分析僅基于靜態(tài)圖像，圖像切面單一且無法提供病灶增強(qiáng)的連續(xù)過程。而超聲檢查具有無創(chuàng)、實時、多切面成像的優(yōu)勢，檢查者可以根據(jù)病灶特征，選取最佳切面顯示病灶，經(jīng)過影像組學(xué)進(jìn)行特征提取，較CT或MRI能提供更多的信息。本課題組前期研究［10］發(fā)現(xiàn)，基于灰階超聲圖像的影像組學(xué)模型預(yù)測HCC 病灶MVI 的準(zhǔn)確率約70%。而基于超聲原始射頻信號的影像組學(xué)模型由于不受儀器、檢查者等因素的干擾，其預(yù)測MVI 的準(zhǔn)確率、敏感性和特異性分別為92.86%、85.71%和100%［14］。

CEUS 能實時、連續(xù)地顯示病灶的增強(qiáng)及消退特征，同時能提供病灶內(nèi)部及周圍微循環(huán)血流灌注信息，對肝臟疾病的診斷具有重要價值。本課題組前期研究［9］顯示，應(yīng)用比較動態(tài)超聲造影特征及定量參數(shù)的差異，有助于預(yù)測HCC 病灶是否出現(xiàn)MVI。結(jié)合臨床因素的預(yù)測模型能顯著提高預(yù)測效能，同時相較于動脈期的影像組學(xué)特征，基于門脈期及延遲期的影像組學(xué)特征在預(yù)測MVI 中具有更重要的價值［15］。Sonazoid 是新型的肝臟特異性超聲造影劑，其主要成分為全氟丁烷微泡，肝內(nèi)的枯否細(xì)胞通過特異性地攝取在枯否期呈高增強(qiáng)，而惡性腫瘤組織由于不含枯否細(xì)胞，在枯否期表現(xiàn)為低回聲增強(qiáng)，故Sonazoid CEUS的枯否期能提供更多的與枯否細(xì)胞相關(guān)的特異性診斷信息。本研究從灰階超聲圖像和Sonazoid CEUS 枯否期圖像中提取特征，對TR、PR 及ER 分別進(jìn)行影像組學(xué)建模，結(jié)果顯示枯否期PR 影像組學(xué)模型與病理確診的MVI 顯著相關(guān)，其預(yù)測MVI 的曲線下面積為0.834，均高于其他影像組學(xué)模型（均P＜0.05）。分析原因可能與MVI 主要發(fā)生在HCC 病灶周圍相關(guān)［3，9-10，14］。既往研究［7］發(fā)現(xiàn)基于HCC 腫瘤區(qū)域與瘤周區(qū)域影像特征建立的影像組學(xué)模型具有相當(dāng)?shù)男埽诠串嬆[瘤ROI 區(qū)時較實際腫瘤區(qū)域稍大，因此導(dǎo)致基于腫瘤ROI區(qū)外擴(kuò)的瘤周區(qū)域影像特征構(gòu)建的影像組學(xué)模型預(yù)測效能較腫瘤區(qū)域的預(yù)測效能稍差。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)模型預(yù)測MVI的閾值概率為0.05～0.85時，枯否期PR 影像組學(xué)評分較其他影像組學(xué)評分能夠提供更高的臨床收益，表明基于Sonazoid CEUS 枯否期PR 影像組學(xué)模型預(yù)測效能較其他影像組學(xué)模型表現(xiàn)更好。

綜上所述，基于Sonazoid CEUS枯否期圖像的影像組學(xué)模型為術(shù)前無創(chuàng)預(yù)測HCC 病灶MVI 提供了新的方法，其中基于枯否期PR 影像組學(xué)特征構(gòu)建的預(yù)測模型效能最佳。