金婷婷 蔣天安 鄭樹森 王利英

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，其致病因素目前尚未完全明確，患者臨床癥狀隱匿不典型，惡性程度和侵襲性高，加之其表達多種耐藥基因，對放療、化療均不敏感，預(yù)后極差，確診后5 年生存率僅10%，嚴重威脅患者身體健康和生命［1］。加強胰腺癌分子機制研究，提高治療效果，延長患者生存時間，是目前亟待解決的問題。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是細胞凋亡與細胞增殖間動態(tài)平衡被破壞的結(jié)果，除放療、化療和手術(shù)治療外，誘導(dǎo)細胞死亡已成為目前抗腫瘤治療的研究熱點。隨著超聲生物學(xué)效應(yīng)的深入研究，超聲治療作為非侵入性的腫瘤治療方法表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。低頻低強度超聲指頻率20 kHz～1 MHz、聲強＜3 W/cm2的超聲波。近年來低頻低強度超聲輻照聯(lián)合微泡造影劑在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、改變細胞通透性、開放生物屏障等方面取得了較好的成就，在腫瘤治療上顯示了較好的潛力［2-3］。本實驗旨在探討惰性氣體微泡聯(lián)合低頻低強度超聲連續(xù)輻照對人胰腺癌PANC-1細胞的抑癌作用，為腫瘤治療提供新的研究思路。

材料與方法

一、主要實驗材料及儀器

1.主要實驗材料：人胰腺癌PANC-1 細胞株（中國科學(xué)院上海細胞與生物研究所細胞資源中心提供）。SonoVue 造影劑（意大利Bracco 公司），為六氟化硫微泡凍干粉，直徑為2～5 μm；0.9%氯化鈉溶液；特級胎牛血清（法國Biowest 公司）；RPMI 1640 液體培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），規(guī)格SH30809.01，含L-谷氨酰胺，不含硝酸鈣；0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。

2.主要儀器：超聲波治療儀（ME740，梅特勒電子股份有限公司），由主機、超聲探頭、可拆卸的醫(yī)用電源、供電電池組和連接線組成，探頭直徑13 mm，頭端呈平面圓形；分析型流式細胞儀（FACSCanto Ⅱ，美國BD公司）。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：先于37.0℃、5%二氧化碳濕化培養(yǎng)箱中將人胰腺癌PANC-1細胞用含15%特級胎牛血清的RPMI 1640 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d 傳代1 次。再用0.25%胰蛋白酶將對數(shù)生長期的人胰腺癌PANC-1細胞消化，收集細胞懸液，1200 r/min 離心3 min，棄上清液，得到濃度為1×106/ml 的人胰腺癌PANC-1 單細胞懸液。

2.分組及處理方法：按處理方法不同分為4 組。①空白對照組：于試管內(nèi)直接加入人胰腺癌PANC-1單細胞懸液2.0 ml；②惰性氣體微泡組：用5.4 ml 0.9%氯化鈉溶液稀釋SonoVue，充分振蕩搖勻，制成混懸液備用；于試管內(nèi)加入1600 μl人胰腺癌PANC-1單細胞懸液和400 μl制備好的SonoVue 混懸液，充分混勻，使微泡濃度達到20%；③低頻低強度超聲組：于試管內(nèi)加入2.0 ml 人胰腺癌PANC-1 單細胞懸液，試管底部均勻涂上超聲耦合劑，置于超聲探頭上，應(yīng)用低頻低強度（1 MHz、0.60 W/cm2）超聲波連續(xù)輻照60 s；④微泡+超聲組：于試管內(nèi)加入1600 μl 人胰腺癌PANC-1單細胞懸液和400 μl SonoVue 混懸液，充分混勻，使微泡濃度達到20%；然后在試管底部均勻涂上超聲耦合劑，置于超聲探頭上，應(yīng)用低頻低強度（1 MHz、0.60 W/cm2）超聲波連續(xù)輻照60 s。

3.檢測細胞增殖活性：將已處理好的細胞接種到96孔板中，每孔約100 μl細胞懸液，置于37.0℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h。每孔分別加入10 μl 細胞計數(shù)試劑，輕拍培養(yǎng)板去除氣泡，使其均勻混合，于培養(yǎng)箱中孵育3 h 后，應(yīng)用雙波長法測定波長450 nm處的吸光度值（設(shè)定450～490 nm 為檢測波長，600～650 nm 為參考波長）。細胞增殖活性以吸光度值表示。同一樣本重復(fù)測量5次取平均值。

4.檢測細胞凋亡情況：將每組人胰腺癌PANC-1細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，于4℃、1000 r/min、離心半徑15 cm 的離心機中離心5 min，棄上清液，將細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入5 μl Annexin V 和5 μl PI混合，避光室溫下反應(yīng)15 min，然后應(yīng)用分析型流式細胞儀分析各組細胞凋亡率。同一樣本重復(fù)測量5次取平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用SNK 多重比較法，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組人胰腺癌PANC-1細胞增殖活性比較

空白對照組、惰性氣體微泡組、低頻低強度超聲組、微泡+超聲組人胰腺癌PANC-1 細胞增殖活性分別為0.9356±0.1652、1.1126±0.0738、0.3236±0.0126、0.1566±0.0137，多組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中微泡+超聲組細胞增殖活性均低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

二、各組人胰腺癌PANC-1細胞凋亡率比較

空白對照組、惰性氣體微泡組、低頻低強度超聲組、微泡+超聲組人胰腺癌PANC-1細胞凋亡率分別為0.069±0.007、0.033±0.006、0.279±0.016、0.678±0.018，多組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中微泡+超聲組細胞凋亡率均高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組人胰腺癌PANC-1細胞凋亡率分析圖

討論

腫瘤學(xué)認為，腫瘤細胞增殖失控和死亡抑制是腫瘤發(fā)生的主要原因，腫瘤細胞的死亡方式包括壞死、自噬和凋亡［4-5］。其中凋亡被稱為Ⅰ型程序性細胞死亡；自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴的降解途徑。腫瘤細胞自噬的作用廣泛，在腫瘤生長發(fā)育和遷移等方面具有重要作用［5］。研究［6］報道當細胞自噬活性超出正常水平時可轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N對抗細胞癌變的機制，過度自噬導(dǎo)致的細胞自噬性死亡可殺滅腫瘤細胞，從而達到抑癌效應(yīng)。超聲波可以殺滅腫瘤細胞，破壞腫瘤組織和間質(zhì)，抑制腫瘤細胞增殖，主要機制為機械效應(yīng)、熱效應(yīng)及空化效應(yīng)；其中空化效應(yīng)指超聲波在液體中傳播時，通過空化核震蕩、膨脹、收縮、崩潰等一系列動力學(xué)過程，產(chǎn)生的休克波使腫瘤細胞膜通透性增加，微血管破裂，內(nèi)皮細胞間隙增大，并介導(dǎo)血管內(nèi)皮層破壞，導(dǎo)致血管內(nèi)微血栓形成，阻斷惡性腫瘤組織的血供［7］。目前超聲治療作為一種安全、無創(chuàng)、無輻射的治療方式已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。超聲造影劑的微氣泡可增強超聲波的空化效應(yīng)，近年來其在腫瘤治療領(lǐng)域的研究有一定進展。研究［8］報道超聲造影劑在抗腫瘤血管作用、血腦屏障和血脊髓屏障開放、免疫療法、誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡、基因靶向治療、藥物輸送等方面均有積極作用。目前最新的第二代超聲造影劑主要有以SonoVue 為代表的包裹惰性氣體的脂質(zhì)體，直徑2～5 μm，不溶于水，穩(wěn)定性較好，在基礎(chǔ)實驗和臨床研究中最為常用。

研究［9］報道微泡造影劑聯(lián)合低頻低強度超聲輻照可引起細胞膜和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞、核內(nèi)染色體中雙螺旋DNA 和基因片段斷裂，導(dǎo)致前列腺癌細胞、肝癌細胞、人白血病細胞等多種癌細胞死亡，具有明顯的抑制癌細胞生長的作用，同時又可減少對正常組織和細胞的損傷。Hou等［10］報道微泡造影劑聯(lián)合低頻超聲可影響腫瘤細胞的低氧反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制增殖，促進腫瘤細胞死亡。Yang 等［11］報道低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑可促使腫瘤細胞凋亡加快，減少細胞增殖，抑制腫瘤生長和血管生成，使腫瘤遷移和侵襲能力明顯減弱。本實驗將惰性氣體微泡與低頻低強度超聲聯(lián)合作用于人胰腺癌PANC-1細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微泡+超聲組細胞增殖活性均低于其余各組，細胞凋亡率均高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），表明惰性氣體微泡聯(lián)合低頻低強度超聲可使人胰腺癌PANC-1細胞增殖活性大大減低，同時可誘導(dǎo)人胰腺癌PANC-1細胞凋亡。

既往文獻［12-13］報道惰性氣體微泡聯(lián)合低頻低強度超聲引起的癌細胞死亡與超聲波頻率、聲強、輻照時間及微泡濃度均密切相關(guān)，即隨著超聲波頻率增加，其空化作用增強，空化閾值降低，癌細胞凋亡增加；隨著超聲波聲強升高、微泡與腫瘤單細胞懸液體積比增加及超聲連續(xù)輻照時間延長，使癌細胞凋亡增加。張蔚等［13］通過重復(fù)正交試驗發(fā)現(xiàn)，微泡與腫瘤單細胞懸液體積比達到20%時可明顯誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，降低腫瘤細胞存活率，從而抑制腫瘤組織增殖、活化及浸潤，發(fā)揮抗癌作用。本實驗因條件有限，未進行重復(fù)正交試驗，故未獲得增加人胰腺癌PANC-1細胞整體凋亡率、抑制腫瘤組織增殖及活化的超聲波頻率、聲強、輻照時間及微泡濃度的相應(yīng)閾值。本課題組下一步將爭取條件實現(xiàn)重復(fù)正交試驗，獲得上述參數(shù)的閾值，并建立兔VX2 胰腺癌模型，探討惰性氣體微泡聯(lián)合低頻低強度超聲連續(xù)輻照對胰腺癌動物模型的抑癌效果。

綜上所述，惰性氣體微泡聯(lián)合低頻低強度超聲輻照能降低體外人胰腺癌PANC-1 細胞增殖活性，誘導(dǎo)細胞凋亡，具有明顯的抑癌作用，為臨床腫瘤治療提供了新的研究思路。