胡連濤，鄧文俊，孫 躒，鹿士振，李學(xué)斌，黎楚豪，王繹博，王欣然，李 玥，王偉群

（1. 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 黑龍江省微生物-免疫調(diào)解網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯1540073；3.佳木斯大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

肝 細(xì) 胞 癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有肝癌病例的90%以上，其發(fā)病率和死亡率分別居于世界第六和第四位［1］。盡管隨著外科技術(shù)手段的不斷提升，有關(guān)LIHC 的臨床和實(shí)驗(yàn)性治療已經(jīng)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但由于術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，患者的整體預(yù)后仍然較差［2，3］。同時(shí)值得關(guān)注的是，多種生物分子均可在LIHC 的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［4］。因此，尋找可靠的LIHC 生物診斷標(biāo)志物和制定新的治療策略仍是LIHC 患者有效治療的必要前提。

蛋白激酶C（PKC）是由絲/蘇氨酸蛋白激酶組成的多基因家族，主要包括PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCλ 和PKCδ 等，PKC 通過(guò)觸發(fā)其下游不同信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，如增殖、分化和凋亡等［5］。蛋白激酶Cδ（PRKCD，PKCδ）是蛋白激酶C 家族的新型同工酶之一，與其他PKC 相同，PRKCD 也由羧基末端激酶結(jié)構(gòu)域、氨基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)構(gòu)成。但PRKCD 調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中只含有二?；视停―AG）或其他磷脂信使激活位點(diǎn)，因而對(duì)Ca2+不敏感［6］。PRKCD 廣泛存在于機(jī)體的各組織和器官中，并在炎癥和腫瘤等多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，PRKCD 的功能基因組改變很少見(jiàn)，而且與癌癥沒(méi)有直接聯(lián)系，這支持了PRKCD 是癌癥“乘客基因”而不是癌癥“驅(qū)動(dòng)基因”的觀點(diǎn)。由此可見(jiàn)，PRKCD 的激活、表達(dá)、定位和/或致癌環(huán)境可能在很大程度上決定這種激酶在癌癥中的功能［7］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析PRKCD 在LIHC 中的表達(dá)及臨床意義，以期為L(zhǎng)IHC 診療的預(yù)后分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)的確立提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床數(shù)據(jù)的挖掘

利用Rstudio 軟件從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/ repository）中下載正常肝組織和LIHC 組織的mRNA-seq 原始數(shù)據(jù)，而初步的臨床數(shù)據(jù)則來(lái)源于UCSC Xena 平臺(tái)。然后對(duì)這二個(gè)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行排序和匯總，并過(guò)濾沒(méi)有TNM 分期的數(shù)據(jù)和其他不完全匹配的數(shù)據(jù)，最終獲得419 例樣本數(shù)據(jù)，包括369 例LIHC 和50 例癌旁組織樣本。原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的規(guī)范化和癌旁與LIHC 組織之間表達(dá)基因的鑒定，均由R 包“edgeR”完成。

1.2 PRKCD 基因在LIHC 和癌旁組織表達(dá)差異的研究

使用R 軟件讀取整理好的TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，應(yīng)用“l(fā)imma”包和“beeswarm”包統(tǒng)計(jì)分析PRKCDmRNA 在LIHC 和癌旁組織的差異表達(dá)情況，并繪制PRKCD 表達(dá)散點(diǎn)差異圖；從Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索PRKCD 的免疫組織化學(xué)染色數(shù)據(jù)（包括染色強(qiáng)度和數(shù)量），以明確LIHC 和正常組織中PRKCD蛋白表達(dá)差異。

1.3 PRKCD表達(dá)與LIHC臨床病理狀態(tài)關(guān)系的研究

應(yīng)用R 軟件讀取TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，然后用接收者操作特性曲線來(lái)計(jì)算曲線下方區(qū)域（AUC）面積，以此判斷PRKCD 在LIHC中的診斷值；應(yīng)用PearsonChi-square 檢驗(yàn)LIHC 中的PRKCD 表達(dá)與其病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性。

1.4 PRKCD 表達(dá)與LIHC 預(yù)后關(guān)系的研究

使用Rstudio 軟件分別讀取TCGA-LIHC 基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料數(shù)據(jù)，應(yīng)用“survival”程序包將樣本中PRKCDmRNA 表達(dá)量的中位數(shù)作為分界點(diǎn)，以此點(diǎn)將患者分為高、低表達(dá)組，分析兩組的生存情況。與此同時(shí)，應(yīng)用“survival”及“survminer”程序包將PRKCD 表達(dá)量、患者年齡、性別、家族癌癥史、TNM 分期、組織學(xué)等級(jí)、Ishak 得分、Child-Pugh 分級(jí)、血管入侵等與總生存期進(jìn)行相關(guān)的單因素和多因素Cox 回歸分析。

1.5 PRKCD 表達(dá)與LIHC 生物過(guò)程和相關(guān)信號(hào)通路關(guān)系的研究

為了分析LIHC 中與PRKCD 表達(dá)相關(guān)的癌癥通路，使用TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA 分析。參考基因集是c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt，用其計(jì)算規(guī)范化富集分?jǐn)?shù)。當(dāng)P值和假發(fā)現(xiàn)率q 值均小于0.05 時(shí)，則認(rèn)為基因集顯著豐富。

1.6 PRKCD 表達(dá)與LIHC 遺傳和表觀遺傳學(xué)關(guān)系的研究

為了分析PRKCD基因表達(dá)變化的原因，從遺傳和表觀遺傳學(xué)的角度利用R 軟件檢測(cè)PRKCD DNA 甲基化和拷貝數(shù)突變與其表達(dá)量之間的關(guān)系。原始數(shù)據(jù)來(lái)源于整理后的TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集，因在CNA 數(shù)據(jù)中有關(guān)拷貝數(shù)深度丟失和深度擴(kuò)增的數(shù)據(jù)過(guò)少，故只考慮了拷貝數(shù)的輕度丟失和輕度的拷貝數(shù)擴(kuò)增與正常二倍體樣本的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 軟件以及SPSS Statistics19.0 軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析LIHC 和癌旁組織中PRKCD 的表達(dá)差異；應(yīng)用PearsonChisquare 分析PRKCD 表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-Meierr 分析PRKCD 表達(dá)與LIHC 患者生存能力的關(guān)系；應(yīng)用單因素和多因素Cox回歸模型分析PRKCD 在LIHC 患者中的預(yù)后意義。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRKCD 在LIHC 組織中表達(dá)上調(diào)

對(duì)TCGA-IHC 數(shù)據(jù)中非配對(duì)的LIHC 及癌旁樣本分析結(jié)果表明，PRKCDmRNA 在LIHC 組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1A）。進(jìn)一步利用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，大多數(shù)LIHC 樣本中PRKCD 蛋白質(zhì)水平亦高于癌旁組織（圖1B）。

圖1 PRKCD 在LIHC 組織中表達(dá)上調(diào)Fig 1 PRKCD expresses an upward adjustment in the LIHC tissues

2.2 PRKCD 表達(dá)與LIHC 患者臨床病理特征具有相關(guān)性

利用TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)將PRKCD 表達(dá)與LIHC 患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PRKCD基因表達(dá)水平與患者TNM 分期（圖2A）、組織學(xué)等級(jí)（圖2B）、AFP 含量（圖2C）和生存狀態(tài)（圖2D）相關(guān)。且隨著TNM 分期的增高、組織學(xué)分化程度的降低、甲胎蛋白水平的升高，PRKCD基因表達(dá)水平有上升的趨勢(shì)。此外，通過(guò)ROC 曲線計(jì)算得出AUC=0.744（P＜0.000 1），說(shuō)明PRKCD表達(dá)水平對(duì)臨床診斷具有一定的診斷準(zhǔn)確性（圖2E）。

圖2 PRKCD 基因表達(dá)與LIHC 患者臨床病理特征相關(guān)性分析Fig 2 Analysis of the correlation between PRKCD gene expression and clinical pathological characteristics in LIHC patients

2.3 PRKCD 表達(dá)上調(diào)與LIHC 患者預(yù)后不良具有相關(guān)性

應(yīng)用Kaplan-Meier 對(duì)TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)中PRKCD基因高、低表達(dá)組總體生存率進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)PRKCD 患者的總體生存率顯著高于高表達(dá)組（P＜0.01），說(shuō)明PRKCD 表達(dá)水平與LIHC 患者預(yù)后相關(guān)（圖3A）。對(duì)TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素及多因素Cox 回歸分析顯示，PRKCD可作為L(zhǎng)IHC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素（表1）。此外，因Cox 回歸分析表明TNM 分期可影響患者的生存能力，故進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan-Meier 在TNM Ⅰ～Ⅳ期中分析PRKCD 表達(dá)與總體生存率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期生存曲線的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）明顯大于Ⅰ、Ⅱ期，說(shuō)明隨著TNM 分期的增高，PRKCD表達(dá)對(duì)患者的危險(xiǎn)作用也隨之增大（圖3B、3C）。

圖3 LIHC 患者生存曲線Fig 3 LIHC patient survival curve

表1 影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析Tabl 1 Analysis of risk factors affecting prognosis in patients with hepatocellular carcinoma

2.4 PRKCD 富集在腫瘤進(jìn)程和相關(guān)信號(hào)通路

為了明確PRKCD 在LIHC 中的功能，我們?cè)诨虮倔w中進(jìn)行GSEA 分析。結(jié)果顯示，PRKCD主要富集在細(xì)胞周期和DNA 復(fù)制等過(guò)程，并與兩者呈正相關(guān)性（圖4A、B）。此外，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)信號(hào)通路分析顯示，PRKCD 主要可參與趨化因子（圖4C）、NOD 樣受體（圖4D）、PPAR（圖4E）、脂肪細(xì)胞因子（圖4F）和T 細(xì)胞受體等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路（圖4G）。

圖4 GSEA 分析圖Fig 4 GSEA analysis

2.5 PRKCD CNA 和甲基化水平影響其表達(dá)

了解PRKCD 表達(dá)變化的原因，本研究從遺傳和表觀遺傳學(xué)的觀點(diǎn)利用R 軟件檢測(cè)TCGA-LIHC中PRKCD的表達(dá)與拷貝數(shù)變異以及甲基化的關(guān)系。結(jié)果顯示，PRKCD基因拷貝數(shù)的增加會(huì)使其表達(dá)水平上升（P＜0.05，圖5A），而隨著PRKCD 甲基化水平的上升，其的表達(dá)量則逐漸降低（圖5B）。

圖5 PRKCD 表達(dá)水平與CNA 和甲基化相關(guān)性分析Fig 5 Analysis of the correlation between the expression level of PRKCD and CNA and methylation

3 討論

既往研究表明，PRKCD 可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［8］。然而，另一些研究則表明，PRKCD可以作為乳腺癌和肺腺癌的癌基因而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［9，10］。這說(shuō)明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，PRKCD 的調(diào)控作用是極其復(fù)雜且矛盾的，其在不同的腫瘤中可能分別具有抑癌或促癌的作用。在抑癌方面，Gonzalez-Guerrico 等［11］在前列腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，佛波酯可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，該過(guò)程是通過(guò)PRKCD參與死亡受體配體的分泌及死亡受體下游凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同樣，Liu 等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，PRKCD 可經(jīng)調(diào)控死亡受體表達(dá)，來(lái)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上研究說(shuō)明，PRKCD 的活化對(duì)于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體和腫瘤壞死因子-α 等死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡極為重要。另外，還有研究表明PRKCD 的耗竭在細(xì)胞死亡導(dǎo)致的退行性疾病和組織損傷中具有保護(hù)作用，通過(guò)用各種毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并同時(shí)上調(diào)PRKCD，PRKCD 可能是凋亡的全局調(diào)控子［13-15］。在促癌方面，Yuan等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PRKCD 抑制劑可以調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的活性，并抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。同樣，Berardi［17］和Chen 等［18］研 究 報(bào) 道，PRKCD 在 多 種 腫 瘤 中均可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的存活。例如，在一項(xiàng)有關(guān)腫瘤惡性表型的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下調(diào)PRKCD 表達(dá)后，干細(xì)胞的自我更新潛能和致癌潛能也隨之被抑制，反之，PRKCD 的激活則可對(duì)腫瘤干細(xì)胞的上述潛能具有促進(jìn)作用，進(jìn)一步機(jī)制研究證實(shí)，一個(gè)持續(xù)存在的、由PRKCD/STAT 3/IL-23/JAK 信號(hào)軸驅(qū)動(dòng)的自分泌反饋機(jī)制在PRKCD 的激活中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［19］。同樣，類似的研究表明，PRKCD 耗竭可以抑制小鼠模型中的乳腺癌、胰腺癌和肺癌腫瘤的形成［20-22］。

盡管人們已經(jīng)開(kāi)展了大量有關(guān)PRKCD 與多種腫瘤相關(guān)性的研究，但其在LIHC 發(fā)生、發(fā)展中的作用卻鮮有報(bào)道。本研究首先從TCGA-LIHC 和HPA 數(shù)據(jù)集中挖掘出的資料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在LIHC 中PRKCD 無(wú)論在mRNA 還是在蛋白表達(dá)水平上均顯著高于癌旁組織或正常肝組織。隨后，我們又證實(shí)PRKCD 表達(dá)與多種LIHC 臨床病理特征具有顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為PRKCD 水平上調(diào)與高TNM分期、高AFP 含量、低分化程度相關(guān)，且ROC 曲線也表明PRKCD 在臨床診斷中具有一定的準(zhǔn)確性。另外，生存曲線和COX 生存分析表明，低表達(dá)PRKCD 的患者生存能力顯著提升，且隨著TNM 分期的增高，PRKCD 表達(dá)對(duì)LIHC 患者生存的危險(xiǎn)作用也隨之增大，故PRKCD 可作為L(zhǎng)IHC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。同時(shí)GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，PRKCD 可能通過(guò)趨化因子、NOD 樣受體、PPAR、脂肪細(xì)胞因子和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路參與細(xì)胞周期和DNA 復(fù)制等過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)LIHC 細(xì)胞的增殖。最后的遺傳和表觀遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PRKCD基因的拷貝數(shù)增加會(huì)使其表達(dá)水平上升，而PRKCD甲基化水平與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本研究主要通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了PRKCD 在LIHC 中的表達(dá)及臨床意義，發(fā)現(xiàn)PRKCD基因可能會(huì)成為L(zhǎng)IHC 臨床預(yù)后評(píng)估的新指標(biāo)和分子靶向治療的新靶點(diǎn)，本研究初步探討了PRKCD 在LIHC 中的可能參與的信號(hào)通路和表達(dá)變化的原因。但由于本研究基于大數(shù)據(jù)分析，具有一定的局限性。因此，后續(xù)研究需要從臨床實(shí)際樣本和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)一步驗(yàn)證和闡述PRKCD 在LIHC 中的表達(dá)、作用及其相關(guān)分子機(jī)制。