蒙婉瑩，劉超宇，夏小燕，李彥炳，李振中，朱曉瑩，廖艷花，黃忠仕

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是發(fā)生于老年時(shí)期的中樞性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)及進(jìn)行性突觸損傷與神經(jīng)元丟失。據(jù)《世界阿爾茨海默病2019 年報(bào)告》［1］報(bào)道，2019 年全球有超過5 500 萬人患有癡呆癥，預(yù)計(jì)到2050 年這個(gè)數(shù)字將增加到1.52 億。GSK-3β 蛋白激酶在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域的重要作用在國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中均被驗(yàn)證［2-4］，目前作為治療靶點(diǎn)在癌癥及神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域中被廣泛研究。二苯乙烯苷（TSG）是蓼科植物何首烏的有效化學(xué)成分之一。近年來國內(nèi)諸多文獻(xiàn)報(bào)道，何首烏及其主要成分TSG 對改善中樞神經(jīng)退行性疾病模型（帕金森癥、血管性癡呆、老年癡呆等）有較好的作用［5，6］，且發(fā)現(xiàn)其改善作用發(fā)生的機(jī)制與一些生物信號通路相關(guān)［7，8］。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，癡呆動(dòng)物模型的腦組織中存在GSK-3β 因子升高的現(xiàn)象；且經(jīng)TSG 干預(yù)后，癡呆動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力有所好轉(zhuǎn)且GSK-3β 的表達(dá)量有所下降，猜測TSG 可以通過調(diào)控GSK-3β 的表達(dá)水平，從而干預(yù)tau 蛋白磷酸化過程［9］。由此，本實(shí)驗(yàn)主要以GSK-3β 因子為中心，通過觀察與GSK-3β 相關(guān)聯(lián)的信號通路及影響因子來更深入探討TSG 經(jīng)GSK-3β 途徑干預(yù)tau 蛋白磷酸化的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用24 月齡老年大鼠來建立Aβ25-35致擬癡呆大鼠模型，在國內(nèi)外研究中，較少使用老年大鼠來進(jìn)行研究，本課題為今后開發(fā)有效低毒的抗癡呆藥物和建立新的有效的癡呆模型提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級24 月齡雄性SD 老年大鼠36只，體質(zhì)量680～720 g，長沙市天勤生物技術(shù)有限公司購入，合格證號SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)由右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開展，批準(zhǔn)號2020101501。

1.1.2 藥物與試劑 TSG（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號：CHB180810）；Aβ25-35（美國SIGMA 公司，批號：118M4892V）；鹽酸塞拉嗪（吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司，批號：190913）；HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200508）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號：070618181227）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：2010A1125）；免疫組化通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：2009B1118）；TRIZOL（美國ThermoScientific公司）；極敏化學(xué)發(fā)光試劑（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：1927b02）；10%聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物技術(shù)有限公司，批號：03512300）；兔抗鼠PI3K 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：26k7234）；兔抗鼠GSK-3β 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：24c3033）；兔抗鼠PKA 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：15j0929）；兔抗鼠tau 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：18s9967）；兔抗鼠p-tau 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：75f5235）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Proteintech-Group 公司，批號：20000174）；兔抗鼠PKC 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：17e3745）；兔抗鼠PKB 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：34d5362）；兔抗鼠GAPDH 多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：62u0922）。

1.1.3 儀器 ZH-藍(lán)星B/S 型大小鼠腦立體定位儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；ZH-KES 型微量注射泵（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；HistoCore PEARL 型自動(dòng)程控脫水機(jī)，EG1150C 型自動(dòng)包埋機(jī)（德國徠卡）；SpactraMax i3x 型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices）；Neofuge15R 型高速冷凍離心機(jī)；Tanon-5200 multi 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀；LightCycler96 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 SD大鼠稱重，甲苯噻嗪（8 mg/kg）腹腔注射麻醉后，使用腦立體定位儀的固定器及耳棒，將大鼠固定于兩滑道正中，壓緊壓鼻環(huán)壓。使用75%酒精消毒大鼠頭頂部剃毛皮膚，使用手術(shù)刀片沿矢狀縫作一3 cm 長的切口，剝離開皮下筋膜，暴露頂骨，使用鑷子將顱骨表面的筋膜及肌肉剝離，將大鼠前鹵定為原點(diǎn)，按大鼠腦立體定位圖譜選擇海馬區(qū)域（前囟后3.5 mm，中線外側(cè)2.0 mm）使用牙科鉆在兩側(cè)鉆出小孔，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)入2.7 mm。將在37 ℃孵育1 周的質(zhì)量濃度為5 μg/μL的Aβ25-35溶液以0.2 μL/min 的速度緩慢注入兩側(cè)腦室，注入體積1 μL，注射完成后留針5 min，避免藥物溢出［10-12］。手術(shù)后縫合頭部皮膚，3 d 內(nèi)每日給予肌注青霉素G10 萬單位預(yù)防感染?？瞻捉M大鼠不做任何處理，且選擇經(jīng)過水迷宮篩選顯示學(xué)習(xí)記憶良好的24 月齡老年大鼠，假手術(shù)組大鼠使用腦立體定位儀顱內(nèi)注射等量生理鹽水，手術(shù)方法及注藥方法同模型組。

1.2.2 癡呆動(dòng)物模型篩選 以15 只3 月齡青年大鼠為訓(xùn)練對象。第1 天讓大鼠適應(yīng)水中環(huán)境，自由游泳4 次，每次2 min。從第2 天起，每天進(jìn)行不同入水方向的4 次水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄逃避潛伏期，2 min內(nèi)未找到終點(diǎn)者以2 min 計(jì)算，4 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，得出青年大鼠平均逃避潛伏期。另取一定數(shù)量的空白組老年大鼠、假手術(shù)組老年大鼠、經(jīng)腦立體定位儀腦內(nèi)注射Aβ25-35溶液的老年大鼠，操作方法同前，記錄每只老年大鼠的平均逃避潛伏期。將青年大鼠平均逃避潛伏期+1 倍標(biāo)準(zhǔn)差值為下限標(biāo)準(zhǔn)，即將青年大鼠平均逃避潛伏期均值+2 倍標(biāo)準(zhǔn)差值為上限標(biāo)準(zhǔn)，排除天生癡呆大鼠及癡呆模型建立失敗的大鼠，共篩選出空白組老年大鼠6 只，假手術(shù)組老年大鼠6 只，老年大鼠癡呆模型24 只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作［13，14］。

1.2.3 動(dòng)物分組及給藥 將24 月齡雄性SD 大鼠36 只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、TSG 低劑量組、TSG 中劑量組、TSG 高劑量組，每組6 只。經(jīng)Aβ25-35海馬區(qū)造模，Morris 水迷宮篩選后開始灌胃給藥，正常組、假手術(shù)組、模型組（生理鹽水，30 mL/kg），TSG 低、中、高劑量組（TSG 分別為0.033、0.1、0.3 g/kg）［9］，每 組 每 日 灌 胃 給 藥1 次，連續(xù)4 周［15］。

1.2.4 病理形態(tài)變化觀察（HE 染色） 將各組大鼠按8 mg/kg 腹腔注射甲苯噻嗪麻醉，使用骨科鉗打開顱骨，暴露大鼠腦組織，使用鑷子剝離左右兩側(cè)海馬組織。用4%多聚甲醛對左側(cè)含海馬體的腦組織塊進(jìn)行固定24 h，石蠟包埋，設(shè)置切片厚度4 μm，70 ℃烤片2 h。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后，置入蒸餾水中。切片置蘇木素染料中染色3 min，使用洗瓶輕柔沖去多余的染料，置鹽酸酒精中分化2～3 s，沖洗后，置于1%伊紅水溶液中染色40 s。梯度酒精脫水、封片。光鏡下觀察組織海馬CA1 區(qū)的病理形態(tài)變化，利用image J 軟件對選取的觀察區(qū)域進(jìn)行自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)操作。

1.2.5 應(yīng)用Real-time PCR 檢測大鼠海馬GSK-3β，PKA，PI3K，PKC，PKBmRNA 的表達(dá) 使用骨科鉗暴露腦組織，取兩側(cè)海馬組織，將大鼠右側(cè)海馬組織按Trizol 試劑盒說明進(jìn)行操作，提取海馬組織內(nèi)總RNA，使用微量紫外分光光度計(jì)檢測RNA 濃度、純度。OD260/OD280比值在1.7～2.0 范圍的RNA可進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。按cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將總RNA 轉(zhuǎn)化cDNA。引物序列合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成，用GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算各目的mRNA 的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 Primers sequence of PCR

1.2.6 免疫組化檢測大鼠海馬區(qū)和腦皮層PKC、PKA 蛋白的表達(dá) 預(yù)凍石蠟塊，切片厚度4 μm，70 ℃烤片2 h。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后，至蒸餾水中待染。切片放入煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液，修復(fù)抗原2 min，每張切片加1 滴或50 μL 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；切片加50 μL 的PKC（按1∶100 稀釋），50 μL 的PKA（按1∶150 稀釋），在4 ℃溫度下孵育過夜；每張切片加50 μL 免疫組化通用試劑盒中的二抗，室溫下孵育15 min；經(jīng)DAB 試劑顯色，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染30 s，自來水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察海馬CA1 區(qū)蛋白表達(dá)量；利用Image Pro plus 軟件對免疫組化切片進(jìn)行分析，將觀察區(qū)域陽性表達(dá)光密度值與觀察區(qū)域面積的比值為平均光密度值，作為PKA、PKC 蛋白的相對表達(dá)量表現(xiàn)形式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測腦組織GSK-3β、P-tau、tau、PI3K、PKB 蛋白的表達(dá) 將大鼠右側(cè)海馬組織按比例（每20 mg 組織加150 μL 蛋白裂解液）加入配制好的蛋白裂解液（RIPA 裂解液：PMSF：磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）放置冰上裂解30 min；裂解完成后，高速冷凍離心機(jī)12 000g、4 ℃、5 min，收集管內(nèi)上清液；按BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定總蛋白濃度，加入4 蛋白上樣緩沖液稀釋后，置100 ℃水浴變性10 min。對變性好的總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，10%SDS-PAGE 凝膠電泳80 V，30 min；再120 V，60 min。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，60 min，25 ℃。使用快速封閉液搖床室溫封閉15 min。將相應(yīng)NC 膜分別置于GSK-3β、p-tau、tau、PI3K、PKB（1∶1 500）中，4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，置于TBST 緩沖液中沖洗3 次，每次5 min。二抗（1∶6 000）于室溫孵育2 h，TBST 緩沖液中沖洗3 次，每次5 min。顯影按照ECL 說明書進(jìn)行操作；應(yīng)用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀分析及進(jìn)行條帶密度掃描，將GSK-3β、PI3K、PKB 條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平，將tau 蛋白的灰度值作為參照，用p-tau/tau 的灰度值之比，作為p-tau 蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對大鼠大腦病理形態(tài)的影響

在顯微鏡下可觀察到，正常組、假手術(shù)組大鼠海馬內(nèi)的錐體細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密整齊有序，且神經(jīng)元及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，著色均勻，核仁清晰，組織片呈淺紅色，鮮見細(xì)胞凋亡，二者細(xì)胞形態(tài)狀態(tài)相似。與正常組及假手術(shù)組相比，模型組大鼠可見海馬神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，分散，不緊密，細(xì)胞邊界不清晰，凋亡水平上升，皮層和海馬內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)量明顯下降。與模型組相較，TSG低、中、高劑量組對大鼠腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均有一定的提升作用，對凋亡水平均有不同程度的改善。見表2、圖1。

圖1 TSG 對大鼠腦內(nèi)海馬及皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響（HE，×400，Bar=20 μm）Fig 1 Effects of TSG on the morphology of nerve cells in hippocampus and cortex of rats（HE，×400，Bar=20 μm）

表2 TSG 對大鼠海馬和大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的影響（n=3，±s）Tab 2 Effects of TSG on the number of nerve cells in hippocampus and cerebral cortex of rats（n=3，±s）

表2 TSG 對大鼠海馬和大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的影響（n=3，±s）Tab 2 Effects of TSG on the number of nerve cells in hippocampus and cerebral cortex of rats（n=3，±s）

注：與正常組比較，bP＜0.01；與假手術(shù)組比較，dP＜0.01；與模型組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)197.00±14.11 225.00±36.17 110.33±10.07bd 138.33±11.37 154.67±14.36e 171.33±14.98f組別正常對照組假手術(shù)組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)245.33±33.47 257.67±35.53 64.67±9.61bd 156.67±25.11f 159.67±21.83f 169.00±69.70f

2.2 對大鼠大腦組織GSK-3β、PI3K、PKB、PKA、PKC mRNA 表達(dá)量的影響

與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組PI3K、PKB、PKCmRNA 表達(dá)量呈下調(diào)趨勢（P＜0.05），GSK-3β、PKAmRNA 表 達(dá) 量 呈 上 調(diào) 趨 勢（P＜0.05）；與空白對照組相比較，假手術(shù)組GSK-3β、PI3K、PKB、PKA、PKCmRNA 表達(dá)量與空白組相當(dāng)，接近于1，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，TSG 各組GSK-3β的mRNA 表達(dá)量呈下降趨勢（P＜0.05），TSG 低劑量組PKAmRNA 表達(dá)量呈下降趨勢（P＜0.05），TSG 各組PI3K和PKC的mRNA 表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），TSG 中劑量組和高劑量組PKB的mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 TSG 對大鼠腦組織GSK-3β、PKA、PI3K、PKB、PKC mRNA 表達(dá)量的影響（n=3，±s）Tab 3 Effects of TSG on mRNA expression levels of GSK-3β，PKA，PI3K，PKB and PKC in rat brain tissue（n=3，±s）

表3 TSG 對大鼠腦組織GSK-3β、PKA、PI3K、PKB、PKC mRNA 表達(dá)量的影響（n=3，±s）Tab 3 Effects of TSG on mRNA expression levels of GSK-3β，PKA，PI3K，PKB and PKC in rat brain tissue（n=3，±s）

注：正常組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)量均為1。與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與假手術(shù)組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與模型組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

?

2.3 對大鼠大腦海馬區(qū)和皮層PKC蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)PKC 的陽性表達(dá)相當(dāng)，無明顯差異；模型組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)PKC 蛋白陽性表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)PKC 蛋白表達(dá)呈陰性，陽性表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，TSG 各組對皮層區(qū)PKC 蛋白的陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.01），TSG 中、高劑量對海馬區(qū)PKC 蛋白的陽性表達(dá)顯著上升，TSG 低劑量組也有提升PKC 蛋白表達(dá)量的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4、圖2。

圖2 TSG 對大鼠海馬區(qū)及皮層區(qū)PKC 蛋白表達(dá)的影響（IHC，Bar=20 μm）Fig 2 Effects of TSG on PKC protein expression in hippocampus and cortex of rats（IHC，Bar=20 μm）

2.4 對大鼠大腦海馬區(qū)和皮層PKA蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組及假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)PKA 蛋白陽性表達(dá)量呈高陽性表達(dá)（P＜0.05）；空白對照組與假手術(shù)組對比，兩者皮層及海馬區(qū)域PKA 均成低表達(dá)狀態(tài)（P＜0.05），平均光密度值相似；與模型組比較，TSG 中、高劑量組對海馬區(qū)PKA 蛋白有下調(diào)作用（P＜0.05），TSG 各劑量組對皮層位置PKA 蛋白都有一定程度的下調(diào)作用（P＜0.05）。見表4、圖3。

圖3 TSG 對大鼠海馬及皮層區(qū)PKA 蛋白表達(dá)的影響（IHC，Bar=20 μm）Fig 3 Effects of TSG on PKA protein expression in hippocampus and cortex of rats（IHC，Bar=20 μm）

表4 TSG 對大鼠海馬和大腦皮層PKC、PKA 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effects of TSG on PKC protein positive cells in hippocampus and cerebral cortex of rats（n=3，±s）

表4 TSG 對大鼠海馬和大腦皮層PKC、PKA 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的影響（n=3，±s）Tab 4 Effects of TSG on PKC protein positive cells in hippocampus and cerebral cortex of rats（n=3，±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與假手術(shù)組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與模型組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

PKC PKA組別海馬區(qū)(MOD)0.000±0.000 1 0.000±0.000 1 0.017±0.001 0ac 0.012±0.001 6e 0.001±0.000 3e 0.001±0.000 1e正常對照組假手術(shù)組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組皮層(MOD)0.011±0.001 9 0.011±0.001 4 0.000±0.000 1bd 0.004±0.000 6f 0.006±0.000 9f 0.006±0.000 1f海馬區(qū)(MOD)0.009±0.000 1 0.010±0.001 2 0.002±0.000 03bd 0.003±0.000 8 0.006±0.000 6f 0.006±0.001 2f皮層(MOD)0.001±0.0001 0.001±0.0001 0.006±0.000 5ac 0.003±0.0003 0.001±0.0001e 0.001±0.0001e

2.5 對大鼠腦組織GSK-3β、t-tau、PI3K 和PKB 蛋白表達(dá)的影響

與正常組及假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠海馬內(nèi)GSK-3β 及P-tau 蛋白的相對表達(dá)量呈上調(diào)狀態(tài)（P＜0.05），PI3K、PKB 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與正常對照組相比，假手術(shù)組海馬內(nèi)GSK-3β、p-tau、PI3K 和PKB 蛋白相對表達(dá)量相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，TSG各組對大腦海馬區(qū)PI3K 及PKB 蛋白均有不同水平的升高作用（P＜0.05），TSG 各組對大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白有下調(diào)趨勢（P＜0.01），TSG 中劑量組對p-tau蛋白的相對表達(dá)量有下降作用（P＜0.05）。見表5、圖4。

圖4 大鼠海馬組織GSK-3β、p-tau、tau、PI3K、PKB 凝膠電泳圖Fig 4 Gel electrophoresis of GSK-3β，p-tau，tau，PI3K and PKB in rat hippocampus

表5 TSG 對大鼠腦組織GSK-3β，p-tau，PI3K 和PKB 蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of TSG on GSK-3β，p-tau，PI3K and PKB protein expression in rat brain tissue（n=3，±s）

表5 TSG 對大鼠腦組織GSK-3β，p-tau，PI3K 和PKB 蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of TSG on GSK-3β，p-tau，PI3K and PKB protein expression in rat brain tissue（n=3，±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與假手術(shù)組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與模型組比較，eP＜0.05，fP＜0.01。

p-tau/tau 0.743±0.041 0.750±0.070 1.067±0.085ac 0.880±0.280 0.760±0.166e 0.845±0.167組別正常對照組假手術(shù)組模型組TSG 低劑量組TSG 中劑量組TSG 高劑量組PI3K/GAPDH 0.823±0.057 0.878±0.077 0.648±0.075ad 0.938±0.033f 1.048±0.104f 0.975±0.076f PKB/GAPDH 1.316±0.357 1.127±0.311 0.414±0.095bd 0.943±0.234e 1.025±0.205e 1.113±0.290f GSK-3β/GAPDH 0.875±0.023 0.834±0.062 1.275±0.107bd 0.924±0.068f 0.870±0.067f 0.778±0.113f

3 討論

tau 蛋白是一種神經(jīng)元微管結(jié)合相關(guān)蛋白，正常狀態(tài)下人體內(nèi)的tau 蛋白的磷酸化/去磷酸化水平保持平衡。在AD 患者腦中，tau 蛋白過度磷酸化，失去與微管結(jié)合的能力，聚集形成的NFT 沉積于腦中則導(dǎo)致神經(jīng)元變性，引起神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡［16，17］。GSK-3β 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅能夠調(diào)節(jié)糖原合成酶活性，目前還作為治療靶點(diǎn)在癌癥及神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域中被廣泛研究。GSK-3β 可加重神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，增加β 淀粉樣蛋白的生成，并降低AD 患者體內(nèi)乙酰膽堿的合成，造成造成神經(jīng)元丟失，與tau 蛋白磷酸化過程、細(xì)胞凋亡及患者記憶障礙密切相關(guān)［18］。本實(shí)驗(yàn)主要研究TSG 經(jīng)GSK-3β 途徑干預(yù)tau 蛋白磷酸化的作用機(jī)制，通過檢測與GSK-3β 相關(guān)因子PI3K、PKB、PKC、PKA 來探討其可能的作用機(jī)制。

在AD 病人的病理切片中可以觀察到大量淀粉樣蛋白斑出現(xiàn)，其主要成分為Aβ 蛋白。Aβ 蛋白是一個(gè)長度大約為40～48 個(gè)氨基酸之間的短肽，是由淀粉樣前體蛋白經(jīng)過分泌酶剪切后產(chǎn)生，其分子量大小約4 kD。研究中使用的造模藥物Aβ25-35是Aβ蛋白在體外水解后得到的片段，體內(nèi)不存在該種物質(zhì)，其本身具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，會(huì)導(dǎo)增加細(xì)胞自由基的損傷、有直接細(xì)胞毒作用、突觸改變、神經(jīng)元死亡等。在本研究中利用24 月齡老年SD 大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35致擬癡呆模型，經(jīng)過水迷宮篩選，該造模方法成功率高，但老年大鼠抵抗力較差，術(shù)后需耗費(fèi)一定護(hù)理時(shí)間。從本實(shí)驗(yàn)HE 染色中可見，TSG 各組海馬區(qū)和皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，較于模型組排列更緊密，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量更多，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡水平降低；但與正常組比較，模型組錐體細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)量較少，且著色較淺，排列相對疏松紊亂?？梢奣SG 對大腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

tau 蛋白磷酸化程度由蛋白激酶和蛋白酯酶的活性二者共同調(diào)控。近年來，GSK-3β 已被確認(rèn)為誘發(fā)tau 蛋白異常磷酸化的主要蛋白激酶，其對神經(jīng)系統(tǒng)的傷害表現(xiàn)在加重神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥，增加Aβ 淀粉樣蛋白斑的生成，還會(huì)使癡呆患者腦內(nèi)乙酰膽堿遞質(zhì)積累水平的下降，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)損害［19，20］。在本實(shí)驗(yàn)中也可觀察到，在Aβ25-35致擬癡呆模型中，可以觀察到GSK-3β 表達(dá)水平的上升，經(jīng)過給予TSG 治療后，其基因水平及蛋白水平的表達(dá)均有一定程度的下降。GSK-3β 可受多種通路因子調(diào)節(jié)，PI3K-Akt 是GSK-3β 其中的一個(gè)上游調(diào)節(jié)通路。近年來，諸多文獻(xiàn)報(bào)道該信號通路與AD 有緊密聯(lián)系［21-23］，推測藥物能通過抑制PI3K-Akt 通路來激活蛋白激酶GSK-3β 的表達(dá)，而GSK-3β 參與tau 蛋白過度磷酸化的過程，加重AD 的癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中利 用RT-time PCR 法，Western blot 法 對GSK-3β、PI3K、PKB mRNA 的表達(dá)及蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，模型組GSK-3β 高表達(dá)的同時(shí)存在著PI3K、PKB 都低表達(dá)的狀態(tài)，且檢測p-tau 蛋白的相對表達(dá)量呈升高趨勢；經(jīng)過TSG 給藥治療后，GSK-3β 的表達(dá)量回降，PI3K、PKB 有升高的趨勢，p-tau 表達(dá)量下降，說明tau 蛋白磷酸化程度下降。

PKC 在記憶形成中起關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)［24，25］，GSK-3β 與PKC 之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系，二甲雙胍對SAMP8 鼠具有改善認(rèn)知功能障礙的作用，具有治療AD 的潛力，且發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠降低GSK-3β 及p-tau 的表達(dá)，能夠增加PKC 的表達(dá)，作用途徑可能是二甲雙胍能夠增加PKC 的表達(dá)，從而抑制GSK-3β 的過度激活，同時(shí)使GSK-3β 的磷酸化水平下降；胡椒堿可能通過調(diào)節(jié)衰老小鼠海馬中的PKC 及PI3K- AKT 途徑逆轉(zhuǎn)D-Gal 誘導(dǎo)的GSK-3β激活。在本實(shí)驗(yàn)中利用RT-time PCR 法，Western Blot 法 及 免 疫 組 化 法 對GSK-3β、PKC mRNA 的 表達(dá)及蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，模型組GSK-3β 高表達(dá)的同時(shí)，PKC 低活性、低表達(dá)的狀態(tài)，且此時(shí)p-tau 蛋白的相對表達(dá)量呈升高趨勢，磷酸化程度重；經(jīng)過TSG 給藥治療后，GSK-3β 的表達(dá)量回降，PKC 的表達(dá)量有上調(diào)趨勢，p-tau 表達(dá)下降，一定程度上挽救了p-tau 過度磷酸化的現(xiàn)象。

由于蛋白激酶的底物通常對受體絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍的一級序列具有很高的選擇性，所以單個(gè)激酶不能夠完全磷酸化tau 的所有位點(diǎn)［26］。蛋白激酶A 是催化tau 蛋白磷酸化最重要的蛋白激酶之一，近年有研究顯示，PKA 與GSK-3β 之間相互影響，PKA 活性增加后，會(huì)導(dǎo)致GSK-3β 的過度激活；PKA 對tau 的 預(yù) 磷 酸 化，使GSK-3β 對tau 蛋 白 的 進(jìn)一步磷酸化有增強(qiáng)作用，PKA 的預(yù)磷酸化可在多個(gè)位點(diǎn)顯著促進(jìn)GSK-3β 調(diào)控的tau 蛋白磷酸化過程，從而導(dǎo)致tau 蛋白過度磷酸化［27-29］。在本實(shí)驗(yàn)中利用RT-time PCR 法，Western blot 法 及 免 疫 組 化 法對GSK-3β、PKA mRNA 的表達(dá)及蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，模型組GSK-3β 高表達(dá)的同時(shí)，PKA 也在模型組中高表達(dá)，模型組tau 蛋白磷酸化程度也呈現(xiàn)過度磷酸化；經(jīng)過TSG 給藥治療后，GSK-3β 的表達(dá)量回降，PKA 的表達(dá)量有下調(diào)，p-tau 表達(dá)下降。由此推測，TSG 通過GSK-3β 途徑干預(yù)tau 蛋白磷酸化的作用機(jī)制如下：一是通過激活PI3K-PKB 通路，從而導(dǎo)致GSK-3β 水平的降低，減少蛋白激酶活性；二是通過增加PKC 的表達(dá)，減少GSK-3β 蛋白激酶活性；三是通過抑制PKA 活性，未經(jīng)過PKA 預(yù)磷酸化的tau 蛋白不易處于過磷酸化的狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)tau 蛋白磷酸化的過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TSG 對Aβ25-35致擬癡呆大鼠模型海馬組織內(nèi)的GSK-3β、PI3K、PKC、PKB、PKA 具有調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)這些因子的表達(dá)，抑制tau 蛋白過度磷酸化，有機(jī)會(huì)改善tau 蛋白過度磷酸化的現(xiàn)象，從而有治療AD 的可能。但其涉及的具體機(jī)制及具體靶點(diǎn)尚未清楚，還需更多的基礎(chǔ)研究。